LC 基因在细胞自噬过程中的表达研究

倪志华+张玉明+邓传怀+等

摘要：自噬是细胞为维持自身代谢发生的胞质组分降解的动态过程。自噬不仅是细胞在饥饿环境下的一种适应性反应，而且对于组织和细胞维持动态平衡十分重要。细胞自噬出现问题往往会导致多种疾病。自噬相关基因被命名为Atg（Autophagy-related gene），LC3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3）是哺乳动物中了解的最透彻的一个Atg同源蛋白。LC3蛋白在细胞中存在两种剪切形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ， 定位于自噬体膜的LC3-Ⅱ是自噬的标志性分子。详细论述自噬过程和LC3在自噬过程中的表达修饰过程，并进一步讨论自噬在神经退行性疾病和微生物感染中的生物学功能。

关键词：自噬；LC3；神经退行性疾病；免疫应答

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-4932-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.002

Expression of LC3 Gene in Cell Autophagy

NI Zhi-hua1，2，ZHANG Yu-ming1，DENG Chuan-huai1，ZHAO Ze1，ZHANG Rui-ying1，ZHOU Yan-fen1，2

（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China；

2.Research Center of Bioengineering of Hebei Province，Baoding 071002，Hebei，China）

Abstract：Autophagy is a dynamic process for degradation of cytosolic components in cell， aiming to maintain cells metabolic balance. Autophagy is an adaptive reaction of nutrient deficiency. Moreover， autophagy is very important for tissue and cell to keep dynamic metabolic balance. Disturbance of autophagy could trigger various diseases. Usually， autophagy-related gene is named as Atg. Microtuble associated protein lightchain 3 （LC3）， a mammalian homolog of yeast Atg8， has been extensively reported. In cell，LC3 proteins are presented in two forms （LC3-Ⅰand LC3-Ⅱ）. LC3-Ⅱ， locating on autophosome membrane， is usually used as a specific marker to monitor autophagy. In this review， the process of autophagy and the function of LC3 were involved. Moreover， the biological function of autophagy in neurodegenerative disease and immune response were also discussed intensively.

Key words：autophagy；LC3；neurodegenerative disease；immune response

自噬（Autophagy）一词源于希腊词语“Self”和“Eating”，指细胞为了维持自身的代谢平衡而自我牺牲的一种重要的细胞功能[1]。1993年，Tsukada等[2]发现了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的细胞自噬现象，并对自噬相关的基因突变体以Atg（Autophagy-related gene）进行了命名和性质研究。从酵母到哺乳动物，细胞自噬过程是高度保守的。目前，哺乳动物的多种组织和器官中都观测到了自噬的发生。研究发现，自噬途径对细胞清除功能缺陷的蛋白质和细胞器，维持细胞的生存、分化，组织的发育十分重要[3]。如果自噬途径受损或自噬相关基因的改变会导致一系列的疾病，例如神经退行性疾病及各种癌症[4]。本文将就自噬过程以及哺乳动物细胞中参与自噬的标志性分子LC3 （Microtubule-associated protein 1 light chain 3）在自噬过程中的表达修饰概述，并阐述自噬在神经退行性疾病和免疫应答反应中的生物学功能。

1 自噬过程

细胞自噬包括三种主要类型：大自噬（Macroautophagy）、小自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone mediated autophagy，CMA），此外还有一些器官特异性的自噬途径[5]。其中大自噬（以后简称为自噬，Autophagy）是细胞内自身发生的大规模的降解过程，包括细胞质组分的降解和细胞器成分的分解。待降解的细胞组分会被称为自噬体的双层膜结构所包裹，然后被运送至溶酶体中进行降解。小自噬是不需任何载体的协助，溶酶体直接摄取细胞组分并进行降解的过程[6]。分子伴侣介导的自噬有别于大自噬和小自噬的是，待降解的底物蛋白必须存在一段五肽序列，热休克蛋白HSP70与底物蛋白结合形成底物-分子伴侣复合物，溶酶体CMA受体识别该复合物，并将底物去折叠后转运至溶酶体中进行消化[7]。

自噬是从酵母到哺乳动物细胞都普遍存在的保守的代谢途径。一般认为自噬的动态过程分成5个紧密相连的步骤：欧米伽体（Omegasome）的形成，自噬体膜的形成与延伸，自噬体的形成，自噬体—溶酶体的融合，自噬体内物质被溶酶体水解酶降解等过程[8]。

细胞自噬过程大多可在10～15 min内完成，如图1所示。首先是mTOR（mammalian target of rapamycin）激酶信号途径激活细胞内的泛素样激酶1（Ubiquitin like kinase 1，ULK）-Atg13-FIP200（Focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD）-Atg101复合物，诱导自噬的起始。随着自噬的开始，内质网通过与DFCP1（Double FYVE-containing protein 1）结合形成欧米伽体，同时，Atg13招募Atg14-Vps34（PI3KC3的激酶亚基）-beclin1蛋白，促进自噬体膜的形成并为自噬体的形成贮备原料。欧米伽体与Atg5-Atg12-Atg16L复合物结合形成孤立的自噬膜结构，该膜结构的进一步延伸过程中细胞质组分包括线粒体和内质网被包裹起来。随着自噬体膜结构的进一步延伸，Atg5-Atg12-Atg16L从膜上解离，膜结构发生闭合，形成自噬体，LC3-II在自噬体的形成过程中定位于封闭的自噬体膜结构上。最后溶酶体与自噬体发生融合，形成自噬体-溶酶体复合物。在自噬体-溶酶体复合物内，被包裹的细胞质组分被溶酶体中的水解酶所降解，其中LC3-II也随之降解。降解结束后，从自噬体-溶酶体复合物变成长形结构的原溶酶体，原溶酶体在细胞中会再次形成溶酶体。

由此可见，在哺乳动物细胞中，核心的Atg蛋白分成5个亚组：ULK1蛋白激酶复合物[9]、Vps34-beclin1 III型PI3-激酶复合物、Atg9-WIPI1（WD-repeat domain protein interacting with phosphoinositides）复合物[10]、Atg12结合系统[11]以及LC3结合系统[12]。对于自噬的发生，顺序进入的蛋白激酶复合物、磷酸化酶、脂类以及ATP依赖的结合系统复合物是必需的，缺少任何一个组分均会导致自噬受损。自噬启动之初，PI3激酶和mTOR激酶是必需的[13]，Vps34-beclin1 III型PI3激酶复合物在自噬中也是必不可少的[14]，此外，自噬过程中还有两个泛素化系统Atg12结合系统和LC3结合系统对自噬体的形成十分重要。

自噬过程主要是由mTOR信号通路调节。在生理条件下，mTOR途径通过抑制泛素样激酶ULK的活性来抑制自噬的发生[6]。在饥饿状态下，mTOR的活性被抑制，ULK被激活从而诱导细胞启动细胞自噬。因此，mTOR可激活饥饿诱导的细胞自噬细胞。

2 LC3在自噬过程中的表达

自噬相关基因（Autophagy-related genes）对于细胞及生物个体十分重要，自噬相关基因的缺失不仅会导致酵母细胞和黏细菌细胞的快速死亡，而且对于刚脱离母体的新生小鼠也是致命的。缺失自噬相关基因的小鼠表现为神经细胞和肝细胞蛋白质的积累[15]。

大多数自噬相关基因在酵母、真菌、多细胞动物和绿色植物以及几种原生动物中都相对保守。自噬相关基因Atg8（Autophagy-related 8 genes，Atg8s）的研究起源于酵母。到目前为止在哺乳动物中至少发现了4个Atg8的同源物：LC3、GABARAP、GATE-16、Atg8L[16]。其中，LC3是了解的最透彻的一个Atg8同源蛋白，目前已知人类有4个编码LC3的基因（MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C）[17]，分别定位于染色体20q11.22、16q24.2、12q24.22和1q43。蛋白质三级结构研究发现，LC3和其他Atg8家族的蛋白结构类似，如图2所示[18]，因其有与泛素十分相似的结构，被称为泛素样蛋白。作为自噬形成中重要的一个组分，LC3结合系统的目的是进行磷脂化（PE），因此LC3连接系统也被称为LC3-脂化系统。LC3蛋白在细胞中存在两种剪切形式LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，LC3-Ⅰ定位于细胞质，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜。

细胞营养缺乏时，LC3基因的转录被激活，从而翻译出足够的LC3前体。在自噬体膜形成过程中，LC3前体被Atg4B剪切形成具有C-末端甘氨酸的胞质形式——LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ的C末端甘氨酸帮助催化其与Atg7和Atg3活性位点处的半胱氨酸形成硫酯键，并且促进LC3-Ⅰ与磷脂以酰胺键进行结合形成LC3-PE，即膜结合形式的LC3-Ⅱ[19]。整个反应过程由Atg7和Atg3介导并且有泛素化折叠。随着自噬体的形成，LC3-Ⅱ逐渐聚集并定位于自噬体膜上。在此过程中LC3-Ⅱ的表达量逐渐增加[20]。之后，自噬体与溶酶体融合，自噬溶酶体降解，自噬体膜表面的LC3-Ⅱ被Atg4B脂化重新变成LC3-Ⅰ，以完成LC3-Ⅰ在自噬体形成过程中的再次利用[21]；自噬溶酶体内的LC3-Ⅱ被溶酶体的水解酶降解。LC3-Ⅰ修饰成LC3-II 的过程不是孤立的，此过程会受到很多因素的影响。在缺乏Atg12-Atg5的结合时，修饰过程无法进行[22]。此外，有学者发现了两个新的自噬调节因子Nix（BCL2-related protein） 和 DOR （Diabetes- and obesity-regulated gene），能够与LC3蛋白结合参与自噬过程中靶蛋白的选择或者自噬体的形成与聚集[23，24]。

LC3-Ⅱ对于自噬体的形成十分必要，有研究表明去除LC3-Ⅱ将形成一系列不闭合的自噬体结构[25]。因LC3-Ⅱ的数量和自噬体的数量存在一一对应的关系，LC3-Ⅱ被普遍认为是哺乳动物自噬体的标记物。试验中常常通过Western blotting、免疫荧光和GFP-LC3法检测LC3用以衡量细胞或组织的自噬行为[26]。

3 自噬的生物学功能

自噬的功能首先是细胞在饥饿环境下的一种适应性反应[27]。细胞处于营养缺乏的环境时，会启动自噬来重复利用自身的材料产生游离的氨基酸以应对饥饿胁迫[28]。自噬在细胞的发育和分化过程中起着十分重要的作用[29]。在细胞发育、变态和细胞分化过程中细胞重塑的动态过程需要细胞成分的大规模降解。研究证明在米曲霉[30]乃至人的角质细胞[31]、皮肤和毛发的分化[32]、心肌细胞分化和心脏发育[33]、T细胞的发育分化过程中[34]都需要Atg基因的参与。

此外，研究发现自噬过程对于组织和细胞维持动态平衡十分重要。细胞自噬与多种疾病相关，例如神经退行性疾病、病原微生物所引发的细胞免疫应答、心肌病、肿瘤、糖尿病、脂肪肝及克罗恩病等[35-37]。

神经退行性疾病包括阿尔兹海默症（Alzheimers diseases，AD）、帕金森病（Parkinsons disease，PD）、亨廷顿舞蹈症（Huntingtons disease，HD）等[38]。自噬异常在这些疾病的病理学和发病过程中起着十分重要的作用。神经元细胞是高度分化的极性细胞，其活力和功能的维持除了需要有赖于神经营养因子的存在，还必须活跃的膜运输在细胞体与树突和轴突之间进行连接。神经元细胞的高度极化特性，也使其对细胞质组分或细胞膜的聚集和积累更加敏感，而要清除错误折叠的蛋白质其中最重要的途径之一就是自噬-溶酶体途径。该途径可以在细胞内对胞浆的长寿蛋白和细胞器进行降解[39]。因此，在神经系统中，自噬的主要作用是维持神经元细胞内蛋白的合成与降解水平的平衡，对于诸如神经细胞这样的长寿细胞，自噬功能和自噬水平的稳定尤其重要。当自噬功能异常时往往会导致神经退行性疾病[40，41]。

此外，自噬的管家功能是与先天性和获得性免疫相关[42]，使细胞远离不必要的或者可能有毒的环境及作为监控体系控制病原体入侵自噬具有胞内抗病毒作用。病原微生物感染可以通过不同的途径影响自噬。一方面自噬作为防御机制参与先天性免疫或者获得性免疫。当病原微生物侵入细胞后，即被自噬识别，然后被自噬体吞噬，最终被自噬溶酶体降解。另一方面，有些病原菌也进化出了不同的策略来破坏自噬途径，从而逃脱了溶酶体的降解并利用该途径所产生的氨基酸进行菌体代谢。这时自噬的功能就变成了清除感染的细胞[43]。自噬清除病原体的能力与病原体自身的性质有关。目前研究发现，当细胞感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）或者A群链球菌（Group A streptococcus）时，自噬不仅承担清除入侵者的任务还在有2型MHC存在时起着递呈抗原的作用。在病毒侵染时，自噬体以病毒组分作为靶标，启动溶酶体降解系统降解病毒粒子和病毒的主要组分，在病毒感染的免疫应答系统启动过程中发挥重要作用[44]。总之，精确测定自噬活性对于研究感染后的免疫应答十分重要，而且调节自噬活性也将成为抗感染治疗的一种途径。

4 展望

自噬作为维持自身平衡的重要细胞代谢过程，担负着重复利用细胞质中游离物质和清除受损细胞器和有毒分子的作用。LC3的结构和在细胞自噬中的作用已经研究清楚，LC3检测已经成为自噬体检测的一种重要手段。

研究表明，除了应对营养缺乏所致的细胞饥饿，自噬还可以清除细胞代谢过程中产生的错误折叠蛋白，以维持细胞正常的生理功能，并且在细胞感染微生物后积极地参与细胞免疫。自噬功能的缺乏或异常可能是神经退行性疾病的主要原因。总之，研究自噬会对相关疾病的发病机理和治疗起到重要的推动作用。

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