葛根素诱导破骨细胞自噬的机制研究

黄漫华等

[摘要] 目的 观察葛根素（Pur）对破骨细胞自噬的影响，探讨其诱导破骨细胞自噬的机制。 方法 采用骨髓干细胞分化的方式培养原代破骨细胞，并按加入Pur量的不同，分成10、50、100 μg/L的Pur组和空白对照组，采用免疫印迹技术（Western-Blot）检测提取的自噬相关蛋白及Akt-mTOR通路相关蛋白的表达。 结果 ①10、50、100 μg/L浓度的Pur组与空白对照组比较，其膜型与胞质型微管相关蛋白1轻链3的比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）均升高（P < 0.01）；10、100 μg/L浓度的Pur组与对照组比较，p62蛋白消耗均增加（P < 0.05）。②10、50、100 μg/L浓度的Pur组与空白对照组比较，酸化核糖体蛋白（p-s6）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）均消耗增多（P < 0.05）。 结论 Pur能够促进破骨细胞自噬，Akt-mTOR通路或许是Pur诱导破骨细胞自噬的机制之一。

[关键词] 葛根素；破骨细胞；自噬；Akt-mTOR通路

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）05（c）-0020-04

[Abstract] Objective To investigate the signaling pathway of puerarin on osteoclasts through autophagy. Methods Osteoclasts were derived from bone marrow stem cells and divided into four groups based on the treated with different concentration of puerarin （0， 10， 50， 100 μg/L groups）. Expression of LC3Ⅱ/Ⅰ， p62， Akt， p-Akt and p-s6 were analyzed by Western-Blot. Results ①Increased LC3Ⅱ/Ⅰ level （10， 50， 100 μg/L groups） and decreased p62 expression （10， 100 μg/L groups） were observed in puerarin-treated groups compared with normal group （P < 0.01 or P < 0.05）. ②Puerarin inhibited the expression of p-Akt， Akt and p-s6 （P < 0.05）. Conclusion Puerarin can promote the autophagy of osteoclasts and may regulate via Akt-mTOR signaling pathway.

[Key words] Puerarin； Osteoclasts； Autophagy； Akt-mTOR signal transduction pathway

葛根在最早的药学著作《神农本草经》中便有记载，因其能治疗“诸痹”等作用而成为治疗骨质疏松症的一味常用而有效的中药，它可增加骨密度和骨量，改善骨构造而达到治疗作用[1-2]。近年来研究显示，中药葛根在防治骨质疏松症的体内外实验方面都取得了良好的效果，而葛根素（puerarin，Pur）在葛根的提取物异黄酮类化合物中含量最高，是其特有的主要有效成分，因此Pur的作用机制研究成了研究葛根的热点领域[3]。Pur能够促进成骨细胞形成与分化[4]，增加血清碱性磷酸酶（ALP）的表达[5]，而且有文献提出，Pur还能对破骨细胞的活性产生一定的抑制作用[6]。在分子水平上，有文献指出，Pur能通过促进自噬作用来保护1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP+）诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤[7]。另外有研究提出，破骨细胞自噬水平的提高会对其活性及分化过程起负向调控作用[8]，但其具体机制尚未明确。本研究通过观察不同浓度Pur组和不加入Pur的对照组对破骨细胞自噬的影响，探究其自噬的相关信号通路，旨在从分子水平上探讨Pur对破骨细胞自噬的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄不分雌雄的昆明（KM）小鼠，无特定病原体（SPF）级，由广东省中医院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器

葛根素（阿拉丁公司，批号：CAS3681-99-0）；α-MEM培养基、胎牛血清和青链霉素（美国，Hyclone公司）；BCA蛋白质定量测定试剂盒（美国，Thermo公司）；微管相关蛋白1轻链3（LC3）、酸化核糖体蛋白（p-s6）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）和p62蛋白的单克隆抗体（美国，CST公司）；HRP标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物科技有限公司）；电泳仪和湿转印仪（美国，Bio-Rad公司）；BNA-311/（2323）CO2细胞培养箱（美国，Espec公司）。

1.3 细胞提取、培养及给药方法

用原代培养破骨细胞的方式，采用骨髓干细胞定向分化的方法。将2月龄的KM小鼠断颈处死后用75%医用乙醇消毒，在无菌条件下取出小鼠的股骨与胫骨，用2 mL注射器抽出骨髓液，过滤后，按1×106细胞/孔的密度接种于24孔培养板中。在初级培养液（含10%胎牛血清和10%青链霉素的α-MEM培养液）中加入巨噬细胞集落刺激因子（20 ng/ml），置于37℃恒温、5% CO2浓度的培养箱中培养。24 h后换成次级培养液（含10%胎牛血清、10%青链霉素、20 ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子和50 ng/ml的核因子κB受体活化因子配体的α-MEM培养液），继续在上述培养箱中培养，每2天换一次新鲜的次级培养液，并依据细胞形态、抗酒石酸盐磷酸酶染色法等方法鉴定出已分化的破骨细胞。将培养出的破骨细胞随机分为4组：第1组为对照组，换液时不加入Pur；第2组为低剂量Pur组，按10 μg/L浓度加入Pur；第3组为中剂量的Pur组，按10 μg/L浓度加入Pur；第4组为高剂量的Pur组，按100 μg/L浓度加入Pur。继续培养7 d后裂解细胞提取相关蛋白。

1.4 蛋白质印迹法（Western-blot）检测相关蛋白的表达

采用Western-Blot检测不同浓度Pur组和对照组LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Akt、p-Akt和p-s6的蛋白表达。提取各组细胞总蛋白，先用BCA（2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠）法进行蛋白定量测定。加入上样缓冲液，在95℃下变性10 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入LC3、p62、Akt、p-Akt和p-s6单克隆抗体，在4℃环境下过夜，接着用TBST缓冲液洗膜3次，10 min/次，加入二抗，在室温下孵育2 h，再次用TBST缓冲液洗膜。将得到的膜与电化学发光（ECL）试剂充分反应后，曝光于X线胶片上，显影、定影、扫描后进行图像分析。应用Image-Pro Plus 6.0软件对各个特异性条带进行累计吸光度检测，最后以积分吸光度值（IOD）来表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用One-Way ANOVA检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度Pur组和对照组破骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白的Western-blot检测结果

与对照组比较，不同浓度Pur组LC3Ⅱ/Ⅰ比值均升高，且浓度越高，比值越大，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1～2。采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为实验操作的标准化内参，不同浓度Pur组和对照组相比，p62蛋白的消耗均增多，且10 μg/L与100 μg/L Pur组比对照组的p62/GAPDH比值小，差异有统计学意义（P = 0.019、0.036）。见图3～4。

2.2 不同浓度Pur组和对照组破骨细胞Akt-mTOR信号通路相关蛋白p-Akt、Akt和p-s6蛋白的Western-blot检测结果

不同浓度Pur组的p-Akt/Akt比值与对照组相比均降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图5～6。不同浓度Pur组的p-s6均受到明显抑制（P < 0.01）；对p-s6蛋白进行Western-blot检测时，同样使用GAPDH作为实验操作的标准化内参，不同浓度Pur组的p-s6/GAPDH比值与对照组相比均较小，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图7～8。

3 讨论

破骨细胞是一种广泛存在于骨组织的高度分化多核巨细胞，其细胞足体固定在骨质表面，能发挥骨吸收功能。破骨细胞和成骨细胞在正常人体的骨质中处于一种动态平衡状态，一旦出现失衡，将会导致相应的骨病，常见的是骨质疏松症。骨质疏松症是一种以骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，为临床上常见的骨代谢病，主要由于破骨细胞的吸收增加和成骨细胞功能衰减导致的骨组织退行性变，因此治疗上主要从如何抑制骨吸收和促进骨生成方面考虑[9-12]。越来越多的文献表明，在骨组织及各类骨细胞发育成熟过程中，甚至在骨类疾病中发现自噬现象，其通过调节自噬来影响，甚至可以改变骨组织中成骨细胞、破骨细胞和骨细胞之间的平衡，从而改善骨类疾病的预后，这已成为当前研究的热点[13]。细胞自噬是一位比利时科学家在1963年的溶酶体国际会议上首次提出的，是细胞内主要的降解系统，通过将细胞质内大分子物质包裹并传递到溶酶体中进行降解，产生氨基酸和能量，维持细胞内外物质与能量平衡，这对细胞内环境的稳态和细胞生存至关重要[14]，能在细胞质中形成双层膜囊泡，将坏死的细胞器（线粒体、内质网等）或长半衰期蛋白包裹，形成自噬小体，再将其运送至溶酶体，将小体内容物水解消化，再释放至细胞质内循环使用[15]。Pur能有效抑制破骨细胞的骨吸收功能[16]，能够使破骨细胞的自噬作用加强，但其具体机制尚缺乏相关研究。

本研究通过观察Pur对破骨细胞自噬相关蛋白（LC3和p62蛋白）和Akt-mTOR信号通路相关蛋白（Akt、p-Akt和p-s6蛋白）表达的影响，证实Pur能有效促进破骨细胞内的自噬相关蛋白的表达，并发现Akt-mTOR信号通路对该自噬变化有重要作用。LC3是哺乳动物自噬相关基因8（ATG8）的同源物，当自噬激活时，LC3被剪切为LC3Ⅰ，然后被激活进而转化为LC3Ⅱ，而后者是自噬泡膜的重要组成部分，因此，LC3Ⅱ/Ⅰ在一定程度上能代表自噬的激活程度[17]。p62（SQSTM1）是自噬活性的标记蛋白，反映自噬泡的清除速率，该蛋白表达增高则提示自噬流受抑制[18]。Akt-mTOR通路是调节细胞代谢和凋亡的一种重要通路，而Akt蛋白在这条通路中起十分重要的作用[19]。Akt蛋白可以在多种酶和转录因子的作用下活化，从而发挥调节细胞的生理功能。Akt蛋白磷酸化后成为p-Akt蛋白，通过复杂的反应后可以阻止部分调控蛋白的负调控，进而激活蛋白翻译，加快细胞生长而发挥抗凋亡作用。有研究结果显示，p-Akt蛋白表达水平高，则凋亡细胞数少，p-Akt蛋白表达水平低，则凋亡细胞数多[20]；所以Akt蛋白和p-Akt蛋白是Akt-mTOR通路的重要调节蛋白。p-s6蛋白是Akt-mTOR通路活化的效应蛋白，对p-s6蛋白的测量可以在很大程度上了解Akt-mTOR通路的激活情况。本研究中不同浓度Pur组较空白对照组均表现出LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高，而且随着Pur浓度的增高，其比值也相应升高，差异有统计学意义，与此同时，10 μg/L和100 μg/L Pur组的p62蛋白与空白对照组比较，其消耗明显增加，因此认为，Pur有可能通过促进自噬表达的水平而抑制破骨细胞的活性。通过检测Pur对破骨细胞Akt-mTOR信号通路相关蛋白表达的影响发现，不同浓度Pur组与对照组相比，细胞的Akt蛋白和p-Akt蛋白的表达均有不同程度下降，而代表Akt-mTOR通路活化程度的p-s6蛋白表达减少，说明Pur对Akt-mTOR信号通路的相关蛋白具有抑制作用，这可能是Pur诱导自噬细胞激活的关键信号通路之一。

本实验结果从分子水平上说明Pur有诱导破骨细胞自噬的作用，而Akt-mTOR信号通路可能是Pur诱导破骨细胞自噬变化的机制之一，但Akt-mTOR信号通路是否为其有效的主要通路，仍需后续实验从不同角度验证其作用，另外其他相关信号通路是否也参与此过程，还有待进一步研究。

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（收稿日期：2015-02-25 本文编辑：李亚聪）