紫花苜蓿子叶的高频离体再生体系的建立与优化

徐博 任伟 王英哲 等

摘要：以东北地区农艺性状优良的不同品种紫花苜蓿的子叶为材料，研究了不同培养基和不同配比对紫花苜蓿愈伤组织诱导和分化的影响。结果表明，最佳胚型愈伤组织诱导培养基为MS+2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT；最佳分化培养基为UM+1.2 mg/L KT；不同基因型在愈伤诱导率上差异显著，其中公农5号表现最佳。紫花苜蓿的高频再生体系的建立，为下一步紫花苜蓿的遗传转化工作打下了坚实的基础。

关键词：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；愈伤诱导；分化；再生

中图分类号：S963.22+3.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5159-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.059

Establishment and Optimization of High-frequency Regeneration System

in Vitro of Medicago sativa Cotyledon

XU Bo1，REN Wei2，WANG Ying-zhe3， SUN Qi-zhong3， GUO Wei4，LOU Yu-jie1

（1. College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China； 2. Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， Jilin， China； 3. Grassland Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Huhhot 010010， China； 4. Jilin Province Animal Husbandry， Changchun 130062， China）

Abstract：The cotyledon and hypocotyI of five varieties of Medicago sativa with fine agronomic characteristics in the northeast China were used to study the effects of different medium and proportions on induction and differentiation of Medicago sativa callus. The results showed that， the optimum embryonic callus induction medium was the MS medium containing a combination of 2， 4-D 2 mg/L and KT 0.5 mg/L； The optimum differentiation medium was the UM medium containing a combination of KT 1.2 mg/L； Significant difference was detected in callus induction ratio of different genotypes of Medicago sativa， in which the best ration was Gongnong NO.5. The establishment of high-frequency regeneration system in vitro of Medicago sativa laid a solid foundation for the next genetic transformation of Medicago sativa.

Key words： Medicago sativa； callus induction； differentiation； regeneration

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上最重要的牧草之一，享有“牧草之王”的美誉，是中国牧草产业化进程中非常重要的牧草之一，其适应性好，可以显著改善土壤理化性质。虽然紫花苜蓿在中国分布广泛，但也存在对不同地区的适应性不强以及被反刍动物取食时发生鼓胀病等问题。基因工程技术作为一种能够对现有品种材料进行遗传改良、获得创新种质的手段，被大量运用于植物的品种改良中。而在利用已知基因建立一个高效的遗传转化体系时，稳定且可操作的植物高频再生体系的建立就显得尤为重要。Sanders等[1]在1972年首次获得了紫花苜蓿的再生植株。植物的再生高度依赖于其基因型，尤其是部分栽培品种的再生都比较困难[2]。而紫花苜蓿的再生也存在这一问题，不同的品种、品系，其再生体系差异较大[3]。研究人员以不同材料、不同外植体为基础材料，成功获得了再生植株[4，5]，但普遍存在再生周期长、再生效率低下及可重复性差等缺点[6]。

由于东北地区冬季十分寒冷，春季存在“倒春寒”问题，导致在该地区种植的紫花苜蓿优良品种相对稀少。中国盐碱地面积较大，在东北地区也有相当面积的盐碱地。苜蓿作为一种中度耐盐植物，将苜蓿种植在轻度盐碱地上，既能改良土壤又能提供饲料，既有经济价值，又能兼顾社会效益和生态效益[5]。耐碱转GsGSTs基因的紫花苜蓿植株，其产量和形态性状与对照差异不显著，但其耐盐性提高明显[6]。在枯草芽孢杆菌的果聚糖合成酶基因转入紫花苜蓿的研究中，获得的转基因苜蓿的耐盐性得到了一定增强[7]。在将HAL1基因转入龙牧803紫花苜蓿的研究中，所得到的转基因苜蓿在NaCl浓度为0.6%～1.0%的范围内依然能够正常生长，而未转基因植株则在NaCl浓度达到0.6%时就全部褐化并死亡[8]。紫花苜蓿公农1号、公农2号、公农5号、龙牧801和龙牧803产量高、抗寒性强，是中国东北地区大面积推广种植的优良苜蓿品种。本研究以适应东北地区的优良苜蓿品种为试验材料，建立了稳定、周期短、可重复的紫花苜蓿高频离体培养体系，为未来建立紫花苜蓿高效遗传转化体系、耐盐性强的优秀种质材料的获得和抗逆性育种研究提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以紫花苜蓿的子叶为试验材料，对公农1号、公农2号、公农5号、龙牧801、龙牧803进行了愈伤诱导和分化比较试验，种子由吉林省农业科学院草地研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的培养 选取各品种紫花苜蓿的饱满种子，分别在75%乙醇灭菌2 min，转入0.1%氯化汞溶液灭菌5 min，以无菌水冲洗3～5次，接种至MS培养基上。

1.2.2 愈伤组织的诱导 无菌苗培养7 d，取子叶，在愈伤组织诱导阶段，采用MS培养基，加不同浓度2，4-D和KT进行培养。试验设9个组合处理：A1，MS+2，4-D 1 mg/L+KT 0.25 mg/L；A2，MS+2，4-D 1 mg/L+KT 0.5 mg/L；A3，MS+2，4-D 1 mg/L+KT 1.0 mg/L；A4，MS+2，4-D 2 mg/L+KT 0.25 mg/L；A5，MS+2，4-D 2 mg/L+KT 0.5 mg/L；A6，MS+2，4-D 2 mg/L+KT 1.0 mg/L；A7，MS+2，4-D 5 mg/L+KT 0.25 mg/L；A8，MS+2，4-D 5 mg/L+KT 0. 5 mg/L；A9，MS+2，4-D 5 mg/L+KT 1.0 mg/L。3次重复，每次重复选100片子叶，每种培养基放20片子叶，愈伤组织诱导阶段培养时间为30 d。所有培养基均加入30 g/L蔗糖、2 g/L琼脂，pH调节至5.8后灭菌，下同。

1.2.3 愈伤组织的分化 在愈伤组织诱导20 d后，将愈伤组织转入含30 g/L蔗糖和不同浓度KT（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/L）的UM培养基中，每20 d更换一次培养基，在分化培养40 d 后统计分化率，每种培养基选择20个愈伤组织，3次重复。整个分化过程培养条件为光照16 h/d，温度25±1 ℃。

1.2.4 根的诱导及移栽 将在分化培养基上萌发的小苗移至蔗糖含量为15 g/L的1/2 MS 培养基上，培养3周后，待根系生长至10 cm左右时，将培养用锥形瓶去掉封口膜，置于室内阴凉处炼苗1 d，洗净根系上的培养基，移栽至含营养土∶蛭石=1∶1的混合基质中，温室培养10 d后统计成活率。

1.3 数据分析

所有数据采用SPSS 16.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导效果

在愈伤组织诱导初期，子叶初步形成质地柔软、颜色透明的愈伤组织，而后其中一部分愈伤组织逐渐形成绿色颗粒状物质。这种含绿色颗粒状的愈伤组织往往能够在分化培养中形成小植株[9]。不同培养基激素配比、形成柔软透明愈伤组织外植体的数量和最终形成绿色颗粒状胚型愈伤组织外植体的数量都差异显著（P<0.05）。从图1可知，黑色柱是柔软型愈伤组织的诱导率，白色柱是胚型愈伤组织的诱导率，A5处理两种类型愈伤组织诱导率均最高。在植物愈伤组织诱导中，2，4-D的通常用量为2 mg/L，尤其在紫花苜蓿的愈伤组织诱导用得较多[10]，而低浓度的KT在愈伤组织的诱导中往往也能起到十分重要的作用。

本研究还对适宜东北地区种植的不同紫花苜蓿品种的愈伤组织诱导率进行了比较。结果（表2）表明，公农5号紫花苜蓿的生长状态和愈伤组织的诱导率高于其他几个品种。

2.2 愈伤组织的分化结果

在将外植体诱导培养30 d后，将胚型愈伤组织转入分化培养基上，愈伤组织上的绿色物质逐渐变硬并开始分化出胚状体，部分胚状体在分化的过程中会同时分生出短小的根系，部分愈伤组织可以分化出多个胚状体并最终形成小植株。在分化阶段，经过40 d后，含1.2 mg/L KT的UM培养基愈伤组织的分化率最高，而更高浓度的KT并没有提高胚状体的数量（表3）。

2.3 根系的培养和植株的移栽结果

1/2 MS培养基是比较合适的生根培养基，而低蔗糖浓度也可以促进紫花苜蓿的根系生长。在分化阶段，大部分分化的胚状体都能够在分化培养基上形成短小的根系，因此在移入生根培养基后，生长状况基本良好。采用了较为合适的移栽方法，移栽后小苗的成活率均可达到90%以上，其中最需注意的是移栽时根系上培养基的清洗。从愈伤组织诱导、分化、生根到移栽的整个过程如图2所示。

3 结论与讨论

3.1 2，4-D和KT对愈伤组织形成和胚性愈伤的作用

本试验发现，2 mg/L 2，4-D作用下愈伤组织的诱导率较高，而加入较低浓度的KT可以促进愈伤组织的形成和胚性愈伤的发生，但其浓度超过一定量时，反而会抑制胚性愈伤组织的产生。在分化时，单独加入一定浓度的KT即可以获得较高的分化率，而且在分化培养后期，大部分幼芽会产生根系，这一方面会提高后期生根培养和成苗的难度，同时也验证了这样的激素配比是较为平衡的培养基组成，对于体细胞胚的产生也是有利的。

3.2 不同品种对植株再生的影响

许多研究表明，不同品种的紫花苜蓿其再生能力有较大差异，而这种差异在不同再生体系中表现也不尽相同。秘鲁苜蓿、金皇后、甘农1号、龙牧801等品种都可用于紫花苜蓿高频再生体系的建立，虽然选用的再生体系都不同，均取得了较高的分化率。一般基因型杂合程度越高，其体细胞胚的形成能力就越强，再生能力也高[10，11]，而这种再生能力是可以高度遗传的[12，13]。本试验选择的公农5号苜蓿其愈伤率高，且分化率也较高，适合进一步用于紫花苜蓿的遗传转化体系的建立。

参考文献：

[1] SAUNDERS J W， BINGHAM E T. Production of alfalfa plants from tissue culture [J].Crop Sci， 1972，12：804-808.

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[4] 王涌鑫，关 宁，李 聪.高效的苜蓿组织培养再生体系的建立[J].东北师大学报（自然科学版），2008，40（3）：112-117.

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[11] 张凌云.苜蓿原生质体分离与体细胞融合条件的研究[D].兰州：甘肃农业大学，2013.

[12] 史 毅.荧光标记的溶菌酶基因（Lyz-GFP）对苜蓿不同品种转化和表达的研究[D].兰州：甘肃农业大学，2013.

[13] 徐春波，王 勇，赵海霞，等.农杆菌介导的紫花苜蓿高效遗传转化体系的研究[J].生物技术通报，2011（4）：93-97.