烟草提取物指纹图谱的比较

刘世君 田友清 丁平 等

摘要：为了优选烟草（Nicotiana tabacum L.）提取物最佳提取方法，采用高效液相色谱法测定了不同条件下超声波制备的烟草提取物。结果表明，在色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-磷酸缓冲液（1∶9），检测波长为259 nm的条件下，通过测定和比较烟草在不同溶剂（水、甲醇）、不同提取时间、不同NaOH浓度、不同超声波频率、不同品种条件下的特征色谱峰情况及参照峰烟碱含量，筛选出以0.5%NaOH水溶液，40 kHz超声波提取30 min为烟草提取物最佳制备工艺，且选择红花烟叶较好，为制备烟草提取物和烟草烟油替代品奠定了基础。

关键词：烟草（Nicotiana tabacum L.）；烟碱；指纹图谱；高效液相色谱

中图分类号：S572 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5108-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.046

Comparison on Fingerprints of Tobacco Extracts from Different Extraction Processes

LIU Shi-jun1，TIAN You-qing1，2，DING Ping1，ZHANG Yun-qing1

（1.Lianyungang TCM Branch， Jiangsu Union Technical Institute， Lianyungang 222007， Jiangsu， China；

2.Lianyungang Common Technological Center for Drug Research and Development， Lianyungang 222007， Jiangsu， China）

Abstract： In order to select the best method for extracting tobacco， the method of HPLC was applied to assay the HPLCs of tobacco extracts from different extraction conditions in ultrasonic process. The results showed that： Under the condition that the separation was performed on a Inertsil ODS-SP column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） with a mobile phase consisting of methanol and phosphate buffer solution （1∶9） and the detection was carried out on a UV detector at 259 nm， the characteristic fingerprints and nicotine content of reference peaks in the conditions of different solvent（water or methol）， time of extraction， NaOH concentration， ultrasonic frequency and source（Tongliao or Lianyungang） were assayed and compared. The selected process was tobacco extracted with ultrasonic wave at 40 kHz for 30 min in water with 0.5% NaOH， and the tobacco from Nicotiana tabacum L. was better， which provides basis for the preparation tobacco extraction and tobacco oil alternative.

Key words： tobacco（Nicotiana tabacum L.）； nicotine； fingerprint； HPLC

.烟草（Nicotiana tabacum L.）为茄科烟草属一年生或有限多年生草本植物，全世界有60多种，其中红花烟草（Nicotiana X sanderae）和黄花烟草（Nicotiana rustica L.）为制造卷烟和烟丝的主要品种。烟草在民间除了主要用于吸食外，还作为药物治疗多种疾病[1，2]。如用烟油（烟草被烟客用烟斗常年抽吸后，在烟杆内积存的烟膏油）治疗蛇虫咬伤、恶疮、顽癣等[3]疗效显著，尤其对带状疱疹更是作用独特[4]。

为了将烟草开发成治疗带状疱疹的药物，以民间烟油为参照，以指纹图谱为指标，通过提取工艺筛选，发现超声波法能较好地体现烟油的成分特征。为了进一步优化超声波法提取工艺，试验拟通过比较不同溶剂、提取时间、NaOH浓度、超声波频率、品种来源的烟草提取物特征性指纹图谱及烟碱提取情况，筛选出较佳的烟草提取物制备条件，旨在为制备烟草提取物和烟草烟油替代品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 烟碱标准品（批号为54-11-5，纯度98%），购自南京春秋生物工程有限公司；甲醇为色谱纯，购自德国默克公司；氢氧化钠为分析纯，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；三乙胺为分析纯，购自天津市永大化学试剂有限公司；磷酸为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，购自上海雅贝科技有限公司；水为纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。

1.1.2 烟油及烟草样品 烟草A，购自内蒙古通辽市木里图镇唐家集市，经丁平副教授鉴定为茄科烟草属植物黄花烟草的干燥全草；烟草B，购自连云港海州庙会市场，产于山东临沂，经丁平副教授鉴定为茄科烟草属植物红花烟草的干燥全草。

1.1.3 仪器 LC-2010型高效液相色谱仪（包括SIL-10ADvp自动进样器、LC-10ADvp输液泵、CTO-10Avp 柱温箱、SPD-10Avp 紫外-可见检测器和LCsolution数据处理软件）（日本岛津公司）；XS105DU型电子天平（瑞典Mettler toledo）；DL-180A型超声波振荡器（上海之信仪器有限公司）；TGL-16M型高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇-磷酸缓冲液（1∶9），检测波长：259 nm，柱温：35 ℃，流速：0.8 mL/min，进样量：10 μL。

1.2.2 溶液制备 取烟碱标准品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成含烟碱2.16 mg/mL的标准品溶液；取干燥烟叶1.0 g，碾碎，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入甲醇（或水）、NaOH，浸泡1 h后，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

1.2.3 参照峰的选择 烟草提取物最多可检测出7个色谱峰，其中共有峰有4个，选择峰面积较大且稳定、峰分离度较好、在5.2 min左右出现的烟碱色谱峰作为参照峰。

1.2.4 烟碱线性关系考察 将上述烟碱标准品溶液依次稀释为2.920 0、1.460 0、0.730 0、0.3650 0、0.182 5、 0.091 25 mg/mL等不同浓度，依照HPLC检测条件进行测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，标准品浓度X（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=1×107X +696 218，r=0.999 6。结果表明，烟碱标准品在0.091 25～2.920 0 mg/mL线性关系良好。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂的烟草指纹图谱比较

分别以甲醇和水为溶剂，加入NaOH 0.20 g（终浓度为1%），超声波提取30 min，所得烟草提取物HPLC见图1。由图1可知，水提取物主要特征峰有7个，甲醇提取物主要特征峰有5个，其中4个（峰1、3、5、6）为二者共有。以烟碱（峰3）为参照，水提取物烟碱平均含量为4.11%（以干燥烟草量计，下同），甲醇提取物烟碱平均含量为1.76%，二者差异极显著（P<0.001），故以水为溶剂优于甲醇。

2.2 不同提取时间的烟草指纹图谱比较

以水为溶剂，加入NaOH 0.20 g（终浓度为1%），分别超声波提取30、60、90 min，所得烟草提取物HPLC见图2。由图2可知，不同提取时间所得提取物主要特征峰均为7个。以烟碱（峰3）为参照，30、60、90 min烟草提取物烟碱平均含量分别为4.11%、4.00%、3.92%，三者间无显著差异（P>0.05）。从节约时间和能源考虑，选择超声波提取30 min。

2.3 不同NaOH浓度的烟草指纹图谱比较

以水为溶剂，分别加入NaOH 0.20 g和0.1 g（终浓度分别为1%和0.5%），超声波提取30 min，所得烟草提取物HPLC见图3。由图3可知，含1%NaOH提取物主要特征峰有7个，含0.5%NaOH提取物主要特征峰有6个，其中峰1，2，3，4，5，6为二者共有。以烟碱（峰3）为参照，含1%和0.5%NaOH烟草提取物烟碱平均含量分别为4.11%和4.05%，两者间无显著差异（P>0.05）。因pH过高会影响色谱柱使用及后续制剂的药效，选择以含0.5%NaOH进行提取。

2.4 不同超声波频率的烟草指纹图谱比较

以水为溶剂，加入NaOH 0.20 g（终浓度为1%），以超声波频率40 kHz和59 kHz提取30 min，所得烟草提取物HPLC见图4。由图4可知，不同频率超声波提取物主要特征峰均为7个。以烟碱（峰3）为参照，40、59 kHz超声波烟草提取物烟碱平均含量分别为3.92%和3.91%，两者间无显著差异（P>0.05）。考虑到超声波频率越低，穿透力越强，选择以40 kHz超声波频率进行提取。

2.5 不同品种烟草指纹图谱比较

取烟草A和烟草B，分别加入NaOH 0.20 g（终浓度为1%），以超声波频率40 kHz提取30 min，所得烟草提取物HPLC见图5。由图5可知，不同产地烟草提取物主要特征峰有一定差别，其中烟草B比烟草A多一个色谱峰（峰7）。以烟碱（峰3）为参照，烟草A提取物烟碱平均含量为3.83%，烟草B提取物烟碱平均含量为4.00%，两者间无显著性差异（P>0.05）。综合考虑其他特征峰及面积，以烟草B为优选。

2.6 指标测定

2.6.1 精密度试验 吸取同一批次供试品溶液10 μL（烟草水提取物），按上述色谱条件连续进样5次，记录色谱图，并计算各特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各特征指纹峰的相对保留时间的RSD在0.95%～1.28%，相对峰面积的RSD在0.86%～1.56%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性试验 精密吸取同一批次供试品溶液10 μL（烟草水提取物），分别在0、4、8、12、24 h 按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，并计算各特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各特征指纹峰的相对保留时间的RSD在0.56%～1.86%，相对峰面积的RSD在0.76%～1.56%，均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.3 重复性试验 制备同一批次5份烟草水提取物，按上述色谱条件进样检测，记录色谱图，并计算各特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各特征指纹峰的相对保留时间的RSD在0.58%～1.48%，相对峰面积的RSD在0.78%～1.82%，均小于2%，表明该方法重复性良好。

3 小结与讨论

指纹图谱作为天然药物或植物提取混合物群质量控制的一种方法，现已得到广泛应用，并已成为国际共识。近年来，指纹图谱技术在烟草行业中的应用研究已取得长足进展，相关报道也逐渐增多[5]。本试验为了筛选烟草提取物制备工艺，以制备出与民间烟草烟油具有相似物质基础的烟草提取物，通过采用高效液相色谱法，比较了烟草在不同溶剂、不同提取时间、不同NaOH浓度、不同超声波频率、不同品种等条件下的特征色谱峰情况及参照峰烟碱含量，发现烟草超声波水提物特征色谱峰数较甲醇提取物多，尤其是烟碱含量二者差异极显著，而与超声波提取时间、NaOH浓度、超声波频率和品种来源等因素关系不大。综合考虑烟碱提取效率、指纹图谱峰数、操作方便、节约能源和时间、对色谱柱使用及后续制剂药效影响等因素，烟草提取物制备以水为溶剂、加入0.5%NaOH、40 kHz超声波提取30 min为最佳工艺，而烟草品种以红花烟草为优，即农民种植的旱烟。

烟碱为烟草中的主要有效成分，具有广泛的药理作用[6]，故本试验选择其作为参照峰。由于烟碱的极性较大，根据相似相溶原理，极性较大的溶剂提取率较高，同时烟碱在碱性水相中为游离态，增加了它的溶解度，因此用含0.5%NaOH的水作为溶剂优于甲醇，与文献报道相一致[7，8]。如果不加NaOH，就很难检测出烟碱，由于进样体积小，且流动相为甲醇-磷酸缓冲溶液，pH偏高一些对色谱柱影响并不大。

参考文献：

[1] 宓鹤鸣，位 华，柳正良.烟草的本草考证及药用研究进展[J].药学实践杂志，2005，23（6）：321-325.

[2] Anne C.Medical uses of tobacco in history[J]. Journal of the royal society of medicine，2004，97（6）：292-296.

[3] 全国中草药汇编编写组.《全国中草药汇编》（下册）[M].北京：人民卫生出版社，1978.

[4] 杜士民，王文胜.烟油治疗带状疱疹的临床观察[J].实用口腔医学杂志，2006，22（4）：546.

[5] 孙 敬，矣 跃，唐徐红，等.烟草指纹图谱技术的研究进展和展望[J].湖北农业科学，2012，51（11）：2164-2168.

[6] JOHN A B. Beneficial effects of nicotine and cigarette smoking： the real， the possible and the spurious[J]. Britiih Medical BullaKn， 1996，52（1）：58-73.

[7] 储志兵，周新光，水恒福，等.超声提取-高效液相色谱法测定烟草中烟碱含量[J].化工技术与开发，2007，36（2）：46-48.

[8] 陈燕舞，廉世勋，尹笃林.烟草中烟碱的高效液相色谱分析综述[J].烟草科技，2006，44（1）：43-45.