细叶百合鳞茎多酚类物质组成及其抗氧化活性

靳磊 刘师源 张萍

摘要：对野生细叶百合（Lilium pumilum DC.）鳞茎多酚类物质组成及其抗氧化能力进行研究，为野生百合资源的合理利用提供科学依据。以宁夏罗山野生细叶百合鳞茎为材料，比较经D-101大孔树脂纯化处理前后细叶百合总多酚含量的变化，使用高效液相色谱法检测分析细叶百合鳞茎内多酚类物质的组成与含量，采用清除DPPH、超氧根离子和羟基自由基3种方法对百合多酚提取物的总抗氧化活性进行评价。结果表明，经D-101大孔树脂纯化后其多酚含量有所降低，但回收率高达92.51%；经高效液相检测分析，11种单体酚化合物在细叶百合鳞茎中被检出，其中杨梅酮和表儿茶素的含量相对较高，分别达到了4.48 mg/100 g和2.91 mg/100 g；细叶百合多酚提取物对DPPH、超氧根离子和羟自由基均具有良好的清除能力，可作为天然抗氧化剂被开发利用。

关键词：细叶百合（Lilium pumilum DC.）；鳞茎；多酚；抗氧化活性

中图分类号：S682.2+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5103-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.045

Polyphenolic Composition and Antioxidant Activities in Bulbs of Lilium pumilum DC.

JIN Lei，LIU Shi-yuan，ZHANG Ping

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021，China）

Abstract： The composition of polyphenols in bulb of L. pumilum DC. were identified and characterized， and its antioxidant activities were studied， in order to obtain the scientific data for wild Lilium resources development and rational utilization. L. pumilum DC.， collected from Luoshan Mountain in Ningxia Autonomous region， was used as metarial， mainly compared to the contents of polyphenols in the bulb before and after purification by using D-101 macroporous resin. Meantime， the composition and content of monomeric phenolic compounds in bulb of L. pumilum DC were analysed by High Performance Liquid Chromatography （HPLC）， and its scavenging abilities to 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals （DPPH）， superoxide anion （O2-·）， and hydroxyl radical （·OH） were respectively determined. The results showed that the content of polyphenols in bulb of L. pumilum DC. was reduced after purification by using D-101 macroporous resin， but with a high recovery rate as 92.51%. HPLC analysis showed that 11 monomeric phenolic compounds were detected in the bulb， and the contents of myricetin and （-） epicatechin were relatively higher， which reached to 4.48 mg/100 g and 2.91 mg/100 g， respectively. The polyphenolic extract of the bulb had strong scavenging abilities to DPPH radical， superoxide anion， and hydroxyl radical， which were always stronger than those of rutin at the same degree of concentration. It is indicated that the bulb of L. pumilum DC.， which not only contained rich phenolic compounds， but also presented high antioxidant activities， may be used as a good natural antioxidant.

Key words： Lilium pumilum DC.； bulb； polyphenols； antioxidant activity

细叶百合（Lilium pumilum DC.）又名山丹，为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生球茎类草本植物，分布于中国宁夏、内蒙古、甘肃、陕西、山西、山东、河南、河北、东北、青海等省区，是百合广布种之一[1]，多生长在海拔400～2 600 m的林缘、草原或山坡草地。2010年《中国药典》将细叶百合、百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）和卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）一同收录其中[2]。研究表明，百合中含有生物碱、多糖、甾体皂苷、磷脂、多酚等多种化学成分，具有抗癌、抗抑郁、抗炎、抗氧化等生物活性[3]。多酚类物质是一类具有一个或多个芳香环，并连接若干羟基的化合物，是植物次生代谢产物中的重要成分，主要包括类黄酮、黄烷醇、花青素和酚酸等，具有抗氧化、抗菌消炎、抗衰老等生物活性，对多种慢性疾病，如糖尿病、心血管疾病和癌症等起到很好的预防和治疗作用[4-6]。

目前研究表明，卷丹鳞茎中多酚类物质具有良好的清除自由基能力[7]；对不同生态型宜昌百合鳞茎中多酚类物质的抗氧化活性进行分析，发现宜昌百合对多种自由基均具有清除作用，并具有良好的铜离子还原能力和抑制脂质过氧化能力[8]。然而，就细叶百合而言，其研究多集中在遗传多样性[9，10]、核型分析[11，12]、组织培养和快繁技术[13，14]等方面，而对其多酚类物质组成和抗氧化活性方面的报道较少，阻碍了其作为保健食品的开发利用。因此，本研究以宁夏罗山野生细叶百合为材料，研究其鳞茎中多酚类物质的组成和抗氧化特性，发掘野生细叶百合潜在的生物保健功能，为细叶百合资源在医药、食品及保健品行业的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生细叶百合于2014年采自宁夏回族自治区中卫市红寺堡区罗山地区（37°18′N，106°16′E，海拔2 504 m）。将百合鳞茎去泥洗净，超低温冷冻干燥后粉碎，过100目筛后待用。

福林-酚试剂由北京奥博星生物技术有限责任公司生产；D-101大孔树脂、色谱甲醇、无水碳酸钠、没食子酸均购自天津博迪化工有限公司，单体酚标准品购自Sigma公司。

1.2 仪器与设备

UV-4803型紫外可见光分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；日本岛津LC-2010型高效液相色谱仪，武汉顿杰测量仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SENCO-R型旋转蒸发仪，上海申生生化仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细叶百合多酚类物质的提取 称取百合干粉10 g，放入装有300 mL 70%乙醇的三角瓶中，混匀后于45 ℃下超声波处理40 min，离心后取上清液，重复提取3次，合并上清液，减压浓缩定容至50 mL。从中移取5 mL，用提取溶剂定容至25 mL，用于纯化前多酚含量的测定。

1.3.2 细叶百合多酚类物质的纯化 D-101大孔树脂使用前用无水乙醇浸泡24 h，蒸馏水冲洗至无味，湿法装柱。将“1.3.1”中获得的提取液上柱，流速4 BV/h，用蒸馏水淋洗至流出液不再浑浊，与浓硫酸-蒽酮无显色反应，再用70%乙醇溶液以4 BV/h的流速解吸，直至检测不到有多酚类物质析出，并测定纯化后多酚类物质的含量。将收集液减压浓缩，冷冻干燥后制成粉末，备用。

1.3.3 多酚类物质含量的测定 采用福林-肖卡法[15]测定，结果以每百克鳞茎中含有的没食子酸质量（mg）表示。

1.3.4 单体酚含量的测定 称取“1.3.2”中百合多酚提取物0.10 g，用5 mL色谱甲醇溶解。取溶液1 mL，经0.22 μm过滤器过滤后，用HPLC进行检测，检测完毕后与标准样品进行比对，进样量为10 μL。色谱条件参照Jin等[16]的方法，结果以每百克细叶百合鳞茎中各单体酚质量（mg）表示。

1.3.5 清除DPPH能力的测定 采用Wangensteen等[17]的方法。称取纯化后百合多酚粉末1.00 g，用无水乙醇分别配制成浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL的溶液。分别吸取待测液0.5 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液（无水乙醇溶解）2.5 mL，加蒸馏水定容至10 mL，摇匀后室温下静置反应30 min，于517 nm处测定其吸光度AT。空白对照A0以0.5 mL无水乙醇代替待测液，结果以自由基清除率表示。

清除率=（1-AT/A0）×100%

1.3.6 清除超氧根离子能力的测定 采用Robak等[18]方法。称取纯化后百合多酚粉末1.00 g，用无水乙醇分别配制成浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL的溶液。分别吸取待测液1.0 mL，依次加入150 μmol/L四唑氮蓝1 mL、468 μmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1 mL，最后加入60 μmol/L吩嗪硫酸甲脂溶液1 mL，于560 nm处测定其吸光度AT。空白对照A0以无水乙醇代替待测液，结果以自由基清除率表示。

清除率=（1-AT/A0）×100%

1.3.7 清除羟基自由基能力的测定 参考Sroka等[19]的方法。依次加入9 mmol/L硫酸亚铁、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L 双氧水各1 mL。于37 ℃下反应15 min， 4 000 r/min离心6 min，于510 nm下测定吸光度AT，空白对照A0以无水乙醇代替待测液，结果以自由基清除率表示。

清除率=（1-AT/A0）×100%

1.4 统计分析

所有试验重复3次，图形利用Excel软件完成，数据统计分析通过SPSS 16.0完成。

2 结果与分析

2.1 提取物纯化前后总多酚含量的比较

纯化处理前，细叶百合总多酚含量为1 564.21 mg/100 g，经D-101大孔树脂纯化后其含量降为1 446.99 mg/100 g（图1）。大孔树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子之间的范德华引力，使有机物根据吸附力及其分子量大小，经过特定溶剂洗脱而达到分离、纯化的目的。本研究中百合鳞茎中多酚类物质的含量显著降低，这可能是由于多酚类物质经大孔树脂吸附后无法完全解析或者在蒸馏水淋洗时部分易溶于水的多酚类物质流失所造成的；虽然经大孔树脂吸附后，分离纯化的多酚类物质有所降低，但回收率达到了92.51%，这表明D-101大孔树脂表现出较好的吸附性能与解析效果，运用大孔树脂纯化和富集百合多酚类化合物是可行的。

2.2 鳞茎中单体酚的含量

为进一步探究细叶百合鳞茎中多酚类物质组分，本研究通过高效液相色谱法对百合鳞茎中11种单体酚的含量进行了定性和定量分析（表1），其中包括3种酚酸类物质（没食子酸、对香豆酸和绿原酸）；5种黄酮醇（芸香糖苷、杨梅酮、芦丁、槲皮素和山奈酚）；2种黄烷醇（儿茶素和表儿茶素）及1种查尔酮（根皮素）。测试的11种单体酚化合物在宁夏罗山野生细叶百合鳞茎中全部被检测出（图2），其中杨梅酮和表儿茶素的含量相对较高，分别达到了4.48 mg/100 g和2.91 mg/100 g。

采用HPLC法对植物酚类物质进行分离鉴定已成为一种可靠、高效的手段。然而由于样品处理方法、仪器设备、色谱分析条件等方面的差异，其分离效果和保留时间也不尽相同，甚至会导致试验结果有较大差异。Robbins等[20]通过对不同色谱柱的选择，使16种酚类物质在70 min内得到了很好的分离；Guillen等[21]也通过对洗脱程序和色谱柱的选择优化，在60 min内将25种酚类物质较好的分离。本研究通过高效液相色谱法在选定的色谱条件下，测定的11种单体酚在60 min内得到了较好的分离。研究结果表明，杨梅酮和表儿茶素在细叶百合鳞茎中相对含量较高，并且11种单体酚化合物均被检出。Francis等[22]在麝香百合（L. longiflorum）中也发现了山奈酚和槲皮素等多酚类物质，但未对其含量进行测定。

2.3 鳞茎中多酚类物质抗氧化活性的测定

2.3.1 多酚对DPPH的清除率 由图3可知，在测试浓度范围内，细叶百合鳞茎多酚提取物和芦丁对DPPH的清除率均随溶液浓度升高而增强，且百合多酚提取物的清除率始终高于芦丁。差异分析表明，DPPH的清除率与细叶百合多酚浓度之间存在显著差异（P<0.05），这表明细叶百合多酚提取物清除DPPH的活性取决于多酚成分的含量。当DPPH的清除率为50%时对应细叶百合鳞茎多酚和芦丁的浓度即为IC50，经计算细叶百合鳞茎多酚和芦丁对DPPH的清除率的IC50分别为0.68 mg/mL和1.41 mg/mL。

2.3.2 鳞茎多酚对O2-·的清除率 细叶百合鳞茎多酚提取物及芦丁对O2-·的清除率在整个测试浓度范围内随溶液浓度的增加而升高，且鳞茎多酚提取物的清除率始终高于芦丁，在达到最大测试浓度2.4 mg/mL时，细叶百合鳞茎多酚对O2-·的清除率高达86.74%（图4）。差异分析表明，O2-·的清除率与细叶百合多酚浓度之间存在显著差异（P<0.05），这表明细叶百合多酚提取物清除O2-·的活性取决于多酚成分的含量。植物体内多酚类化合物含量越高，其体外抗氧化活性越强[23]。经计算细叶百合鳞茎多酚和芦丁对的O2-·的清除率IC50分别为1.14 mg/mL和1.94 mg/mL。

2.3.3 鳞茎多酚对·OH的清除率 由图5可知，浓度为0.8～2.4 mg/mL的细叶百合鳞茎多酚提取物对·OH的清除率随其浓度的升高而增强，且整个测试浓度范围内细叶百合鳞茎多酚提取物的清除率显著高于芦丁（P<0.05），在达到最大测试浓度2.4 mg/mL时，细叶百合鳞茎多酚对·OH的清除率高达75.59%，表明细叶百合鳞茎多酚提取物具有良好的体外抗氧化活性。经计算细叶百合鳞茎多酚和芦丁对的·OH的清除率IC50分别为1.38 mg/mL和3.15 mg/mL。

本研究中选取了清除包括羟自由基、超氧根离子自由基和DPPH自由基在内的3种自由基来评价野生细叶百合鳞茎多酚类物质的抗氧化特性。结果表明，野生细叶百合鳞茎多酚提取物对多种自由基均具有一定的清除能力，并且在整个测试浓度内，野生细叶百合的抗氧化能力显著强于常见抗氧化剂芦丁。这些研究结果暗示野生细叶百合磷茎多酚在天然抗氧化剂和功能性食品开发方面具有广阔的前景。此外，与常见的蔬菜相比，野生细叶百合鳞茎多酚类物质清除自由基的能力强于常见的马铃薯和胡萝卜等蔬菜[24]。本研究结果不仅可以促进百合食品产业的发展，并为野生细叶百合资源的有效利用奠定了基础。

3 小结

野生细叶百合鳞茎多酚类物质经D-101大孔树脂纯化后其含量有所降低，但回收率高达92.51%；经HPLC检测分析，11种单体酚化合物在细叶百合鳞茎中均被检出，其中杨梅酮和表儿茶素的含量相对较高，分别达到了4.48 mg/100 g和2.91 mg/100 g；野生细叶百合鳞茎多酚类物质对多种自由基均具有一定的清除能力，且在整个测试浓度范围内，其抗氧化活性始终高于对应浓度下芦丁的抗氧化活性。研究表明，野生细叶百合鳞茎可作为天然抗氧化活性剂资源被开发利用。

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