山黧豆中β-ODAP及其他氨基酸的提取和HPLC分析

李小波， 樊 琛， 龙立梅， 李 柰， 曹学丽，*， 李雪帆， 牛晓峰， 贾 平

（1.北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心/食品质量与安全北京实验室，北京 100048；2.太原六味斋实业有限公司，山西太原 030401）

山黧豆中β-ODAP及其他氨基酸的提取和HPLC分析

李小波1， 樊 琛1， 龙立梅1， 李 柰1， 曹学丽1，*， 李雪帆2， 牛晓峰2， 贾 平2

（1.北京工商大学食品学院/食品添加剂与配料北京高校工程研究中心/食品质量与安全北京实验室，北京 100048；2.太原六味斋实业有限公司，山西太原 030401）

利用氯甲酸对硝基卞酯（PNZ-Cl）作为柱前衍生化试剂，建立了山黧豆中神经毒素β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸（β-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic，β-ODAP）及其他游离氨基酸的同时分析法。HPLC法为色谱柱Ultimate XB-C18，流动相乙腈和乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值=4.6），梯度洗脱程序0～5 minφ（乙腈）25%，5～30 minφ（乙腈）25%～90%，流速0.8 mL/min，柱温30℃，检测波长300 nm。利用该方法对山黧豆中β-ODAP及其他游离氨基酸的提取条件中乙醇体积分数、山黧豆粉的质量浓度（ρ（山黧豆粉））、提取温度等进行了优化。结果表明，在φ（乙醇）为10%，ρ（山黧豆粉）为0.025 g/mL，提取温度为60℃时，提取效率较高。

山黧豆；β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸；氨基酸

山黧豆（Lathyrus sativus Linn.），又名马牙豆、家山黧豆、山棱豆、栽培香豌豆，木兰纲（Magnoliopsida）蔷薇亚纲（Rosidae）豆目（Fabales）蝶形花科（Fabaceae）野豌豆族（Trib.Vicieae）山黧豆属（Lathyrus），一年生作物［1-3］。由于其具有耐寒、抗旱、抗虫害、固氮肥沃土壤以及低成本高产的特性，在我国东北、西北、华北等地区大面积种植［4］。山黧豆籽实中含有丰富的蛋白质和氨基酸，但也含有一种非蛋白质氨基酸，这种氨基酸含两种同分异构体，一种是β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸（β-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic，β-ODAP），是一种神经毒素，长期食用可引起下肢瘫痪，称为山黧豆中毒［5-8］，由于这种氨基酸的存在妨碍了山黧豆的推广和种植；另一种是α-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙（α-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic，α-ODAP），无毒性［9-10］。研究报道，β-ODAP在种子中的含量变异很大，所以人们一直致力于选育低毒或无毒品种，因而神经毒素β-ODAP含量分析方法颇受关注［11］。鉴于此，本工作拟利用β-ODAP与其他游离氨基酸性质相近的特点，应用柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）进行定性和定量分析，为山黧豆这一新型食物资源的进一步研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山黧豆，山西太原六味斋实业有限公司；β-ODAP标样（纯度＞98%），成都瑞芬思生物科技有限公司；氨基酸混合标样（纯度＞99%）和对硝基氯甲酸苄酯（4-nitrobenzyl chloroformate，PNZ-Cl），美国Sigma公司；甲醇、乙腈均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100型高效液相色谱系统（配有可变波长紫外检测器和Rev.A.09.03色谱工作站），美国安捷伦科技有限公司；超纯泵机，北京德泉兴业商贸有限公司；PHS-3D型pH计，上海三信仪表厂；溶剂过滤器，北京江海科仪科技有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB-B95型循环水式多用途真空泵，郑州长城科工贸有限公司；分析天平，Sartorius公司；4K15型离心机，美国Sigma公司；F500AG型高速多功能粉碎机，北京汇海科仪仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

根据参数文献［12］进行样品前处理。将山黧豆磨碎，过40目筛。准确称取1 g山黧豆粉，加入40 mL提取溶剂，φ（乙醇）为10%，控制提取温度为60℃，ρ（山黧豆粉）=0.025 g/mL（m（山黧豆粉）∶V（提取溶剂）=1 g∶40 mL），超声波处理1 h，静置一晚，在4 000 r/min离心15 min，取上清提取液，将提取液保存于4℃。

1.3.2 标准溶液和样品衍生化

吸取25 μL 17种氨基酸混合标样溶液，25 μL ρ（β-ODAP）=0.5 mg/mL标样溶液，加入200 μLc（NaHCO3）=0.5 mol/L，200 μLc（PNZ-Cl）=5 mmol/L，超声2 min，过0.45 μm滤膜并进样。

取上清提取液200 μL，加入200 μLc（NaHCO3）=0.5 mol/L，200 μLc（PNZ-Cl）=5 mmol/L，超声2 min，过0.45 μm滤膜并进样。

1.3.3 色谱条件的优化［13-15］

分别考察流动相梯度洗脱条件，乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH值、柱温、流动相流速等液相色谱条件对β-ODAP及其他17种氨基酸的分离效果的影响。

1.3.4 样品提取条件的优化

1.3.4.1 乙醇体积分数

取5支试管，分别加入1 g山黧豆粉，按φ（乙醇）分别为10%，30%，50%，70%，90%，加入10 mL提取溶剂，在100 W功率下超声1 h，常温静置一晚，在4000 r/min转速下离心15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。

1.3.4.2 山黧豆粉质量浓度

取6支试管，分别加入1 g山黧豆粉，φ（乙醇）为10%，按ρ（山黧豆粉）为0.10，0.05，0.03，0.025，0.02，0.017 g/mL加入10 mL提取溶剂，在100 W功率下超声1 h，常温静置一晚，在4 000 r/min转速下离心15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。

1.3.4.3 提取温度

取5支试管，分别加入1 g山黧豆粉，φ（乙醇）为10%，按ρ（山黧豆粉）=0.10 g/mL加入10 mL提取溶剂，在100 W功率下超声1 h，在水浴温度分别为30，40，50，60，70℃条件下提取2 h，静置一晚，在4000 r/min转速下离心15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的选择

目前用于HPLC分析的柱前衍生化试剂主要有9-芴基甲基-氯甲酸酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC）［16］、异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）［17］、2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，FDNB）［18］、6-氨基喹啉-N-羟基丁二酰亚胺氨基甲酸酯（6-aminoquinoly-N-hydroxysuccinimidy carbamate，AQC）［19］以及丹磺酰氯（dansyl chloride，Dansyl-Cl）等［20］。但这些衍生化试剂均需要精确控制多种反应条件，衍生化操作复杂，衍生化时间长，衍生化后的产物不稳定。由于PNZ-Cl是一种定量检测生物胺和非蛋白质氨基酸的稳定的衍生化试剂。衍生化反应完成在超声条件和适宜的温度下只需6 min，与之前的柱前衍生化提取方法相比，这种方法快速、简便，测定结果准确，衍生产物一定时间内稳定，可连续测定［21］。

2.2 色谱条件的优化

较佳色谱条件是色谱柱为Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相乙腈和乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值=4.6），梯度洗脱程序0～5 min φ（乙腈）25%，5～30 min φ（乙腈）25%～90%，流速0.8 mL/min，柱温30℃，检测波长300 nm。

2.3 样品提取条件的优化

由于β-ODAP及其他游离氨基酸的提取含量与峰面积呈正相关，所以可以用峰面积大小来表示其提取效率高低。

2.3.1 乙醇体积分数对β-ODAP及氨基酸提取效率的影响

取5支试管，分别加入1 g山黧豆粉，按φ（乙醇）分别为10%，30%，50%，70%，90%，加入10 mL提取溶剂，在100 W功率下超声1 h，常温静置一晚，在4000 r/min转速下离心15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。比较不同的乙醇体积分数下β-ODAP及氨基酸的提取效率，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对β-ODAP及其他游离氨基酸提取效率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction yield of β-ODAP and other free amino acids

由图1可以看出，当φ（乙醇）为10%时，山黧豆中的β-ODAP与其他游离氨基酸的提取率达到较高。

2.3.2 山黧豆粉质量浓度对β-ODAP及氨基酸提取效率的影响

取6支试管，分别加入1 g山黧豆粉，φ（乙醇）为10%，按ρ（山黧豆粉）为0.10，0.05，0.03，0.025，0.02，0.017 g/mL加入10 mL提取溶剂，在100 W功率下超声1h，常温静置一晚，在4000r/min转速下离心15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。比较不同的山黧豆粉质量浓度下β-ODAP及氨基酸的提取效率，结果见图2。

图2 山黧豆粉质量浓度对β-ODAP及其他游离氨基酸提取效率的影响Fig.2 Effects of material concentration on extraction yield of β-ODAP and other free amino acids

由图2可以看出，当ρ（山黧豆粉）为0.025 g/mL时，山黧豆中的β-ODAP与其他游离氨基酸的提取率达到较高，再减小质量浓度，提取率不再变化。

2.3.3 提取温度对β-ODAP及氨基酸提取效率的影响

取5支试管，分别加入1 g山黧豆粉，φ（乙醇）为10%，按ρ（山黧豆粉）=0.10 g/mL加入10 mL提取溶剂，在100 W功率下超声1 h，在水浴温度分别为30，40，50，60，70℃条件下提取2 h，静置一晚，在4000 r/min转速下离心15 min，取上清提取液，分别衍生化处理，分析，每个样品做三次平行实验。比较不同提取温度下的β-ODAP及氨基酸的提取效率，结果见图3。

图3 提取温度对β-ODAP及其他游离氨基酸提取效率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of β-ODAP and other free amino acids

由图3可以看出，当提取温度为60℃时，山黧豆中的β-ODAP与其他游离氨基酸的提取率达到较高，再增加提取温度，其提取率开始下降。

2.4 样品定性及定量分析检测

2.4.1 标样及样品图谱分析

β-ODAP与17种氨基酸混合标样的色谱图见图4a。实验确定较佳提取条件为φ（乙醇）为10%，ρ（山黧豆粉）为0.025 g/mL，提取温度为60℃。在此提取条件下，对山黧豆中的β-ODAP及其他游离氨基酸进行HPLC分析，见图4b。定性分析结果表明山黧豆中明显含有包括β-ODAP在内的16种游离氨基酸，包括β-ODAP、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸。但仍存在未解决的问题，即天冬氨酸和谷氨酸，苯丙氨酸和异亮氨酸没有达到完全分离，所以后面定量分析工作中，将未分开的氨基酸放在一起进行定量分析。

2.4.2 β-ODAP和17种氨基酸标准曲线及结果计算

用β-ODAP和17种氨基酸的浓度与色谱峰面积回归得到工作曲线方程，见表1。实验表明，在实验浓度范围内，呈现很好的线性。由氨基酸标样与山黧豆样品的β-ODAP及17种氨基酸衍生物的HPLC色谱图对比可以看出，山黧豆中明显含有包括β-ODAP在内的16种游离氨基酸。由标准曲线求出各种山黧豆中氨基酸的质量比，见表1。

图4 β-ODAP及17种氨基酸混合标样和较佳提取条件下山黧豆样品氨基酸衍生物的HPLCFig.4 HPLC chromatogram of standard mixture of β-ODAP and 17amino acids derivatized with PNZ-Cl and PNZ-derivatived amino acids from Lathyrus sativus Linn.under optimized conditions

表1 β-ODAP和其他17种游离氨基酸的工作曲线及质量比Tab.1 Calibration curves data and contents of β-ODAP and 17 free amino acids

定量分析结果表明山黧豆中β-ODAP的质量比为0.169 mg/g，16种游离氨基酸中必需氨基酸有6种，分别为苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸，其中苏氨酸和缬氨酸含量都相对较高，均大于0.2 mg/g。非必需氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸。其中天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的质量比相对较高，均大于0.2 mg/g。

3 结 论

本文利用对硝基氯甲酸卞酯（PNZ-Cl）作为柱前衍生化试剂，建立了山黧豆中神经毒素β-N-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸（β-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic，β-ODAP）及其他游离氨基酸的高效液相色谱检测方法。较佳色谱条件是色谱柱为Ultimate XBC18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相乙腈和乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值=4.6），梯度洗脱程序0～5 min φ（乙腈）25%，5～30 min φ（乙腈）25%～90%，流速0.8 mL/min，柱温30℃，检测波长300 nm。该方法快速、简便，在普通的实验室即可实现。本文还比较了φ（乙醇）、ρ（山黧豆粉）和提取温度对提取效率的影响。结果表明：在φ（乙醇）为10%，ρ（山黧豆粉）为0.025 g/mL，提取温度为60℃时，提取效率较高。

该方法可以实现对山黧豆中包括β-ODAP在内的16种游离氨基酸的分析测定，但仍存在未解决的问题，即天冬氨酸和谷氨酸，苯丙氨酸和异亮氨酸没有达到完全分离。定量分析结果也显示，山黧豆中β-ODAP的质量比为0.168 mg/g，必需氨基酸如苏氨酸和缬氨酸质量比都相对较高，均大于0.2 mg/g。非必需氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸的质量比相对较高，均大于0.2 mg/g。本文的研究结果可进一步为山黧豆的开发利用提供实验依据。另外，在此基础上，针对山黧豆的去毒及蛋白质等营养学价值还需进一步研究和探讨。

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Extraction and HPLC Analysis of β-ODAP and Other Amino Acids in Lathyrus Sativus

LI Xiaobo1， FAN Chen1， LONG Limei1， LI Nai1， CAO Xueli1，*，
LI Xuefan2， NIU Xiaofeng2， JIA Ping2
（1.School of Food and Chemical Engineering/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients/Beijing Key Lab of Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Taiyuan Liuweizhai Industry Co.Ltd.，Taiyuan 030401，China）

An high performance liquid chromatographic（HPLC）method was developed to analyze neurotoxin β-N-oxalyl-α，β-diaminopropionic acid（β-ODAP），and other free amino acids in Lathyrus sativus Linn.by precolumn derivatization with para-nitro-benzyloxycarbonyl chloride（PNZ-Cl）.The chromatography conditions were as followed：column of Ultimate XB-C18，acetonitrile and sodium acetate as the mobile phase，gradient elution procedure being 0-5 min φ（acetonitrile）25%，5-30 min φ（acetonitrile）25%-90%，and flow rate 0.8 mL/min，the colum thermostated at 30℃，and detecting wavelength 300 nm.The extraction conditions，such as the ethanol concentration，raw material concentration，and extraction temperature，were optimized using this analytical method.The results showed that higher extraction yield of β-ODAP and other free amino acids was obtained under the conditions of 10%（V∶V）ethanol，material concentration of 0.025 g/mL，and extraction temperature 60℃.

Lathyrus sativus；β-ODAP；amino acids

李 宁）

TS207.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.008

2095-6002（2015）02-0042-06

李小波，樊琛，龙立梅，等.山黧豆中β-ODAP及其他氨基酸的提取和HPLC分析［J］.食品科学技术学报，2015，33（2）：42-47.

LI Xiaobo，FAN Chen，LONG Limei，et al.Extraction and HPLC analysis of β-ODAP and other amino acids in Lathyrus Sativus［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：42-47.

2014-09-12

农业部公益性行业（农业）科研专项（201303069-04）；北京工商大学研究生科研学术创新基金项目。

李小波，女，硕士研究生，研究方向为生物分离工程；

*曹学丽，女，教授，博士，主要从事生物分离和分析方面的研究。

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