新疆“生命营养液”抑菌能力评价及其菌种分离纯化

赵 婷， 吾布利·卡地尔， 翟 磊， 白飞荣， 程 池，*

（1.中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物开发有限公司，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 830000）

新疆“生命营养液”抑菌能力评价及其菌种分离纯化

赵 婷1， 吾布利·卡地尔2， 翟 磊1， 白飞荣1， 程 池1，*

（1.中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物开发有限公司，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 830000）

评价新疆特色功能饮料“生命营养液”，对5种常见食源性致病菌和5种食品常见益生菌的抑菌能力，并对该饮料中微生物菌种进行初步分离纯化。结果显示，“生命营养液”30 μL原液对5种常见食源性致病菌肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp.Enterica）、出血性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EHEC O157∶H7）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas eruginosa）均具有抑菌能力，抑菌圈直径分别为10.5，12.0，12.0，12.5，10.0 mm，对4种常见益生菌植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）均无抑菌能力，仅对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）具有抑菌能力，抑菌圈直径为27.0 mm。从“生命营养液”中分离纯化出3株革兰氏阴性杆状细菌，1株革兰氏阳性杆状细菌，1株产红褐色可溶性色素丝状真菌，初步鉴定为红曲菌属（Monascus sp.）。

抑菌；分离纯化；新疆；功能饮料

“生命营养液”以新疆地区产的核桃、巴旦木、杏仁、黄豆、绿豆、大米、干鲜果类和蔬菜类等50多种天然产品为原料，以传统工艺与现代生物技术相结合，经过独特的方法多次发酵制备而生产，发酵工艺特点为等重量配比的原料粉碎、混合，将混合料与水按质量比为1∶3加水，煮30 min，冷却至常温后过滤，将滤液发酵4个月，第一月18℃无氧发酵，第二和第三个月24℃无氧发酵，最后一个月20℃有氧发酵，是一种新疆地区特色功能性饮料［1］。

研究表明“生命营养液”富含蛋白质、粗脂肪、维生素、矿物质和营养纤维素，能够有效控制并配合治疗心脑血管疾病、糖尿病、各类炎症和男科、妇科疾病、加强免疫系统功能，促进细胞再生、帮助伤口组织愈合，为人体各组织器官提供充足营养［2］。在新疆地区，维吾尔族民间常饮用“生命营养液”用于营养保健，对其有图腾般的崇拜，但其现代医学原理还未深入研究。本文评价了“生命营养液”对5种常见食源性致病菌和5种食品中常见益生菌的抑菌能力，并对其优势微生物菌群进行了初步分离与纯化，为“生命营养液”的抑菌活性及发酵菌株分析及功能性研究提供重要基础参考数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

生命营养液，由新疆埃杜升（ALDOS）生物开发有限公司提供。

1.1.2 实验菌株

5种常见食源性致病菌和5种食品中常见益生菌，均保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），见表1。

表1 实验菌株Tab.1 10 kinds of strains in test

1.1.3 培养基

Mueller-Hinton琼脂培养基（MHA），乳酸细菌培养基（MRS），营养肉汤琼脂培养基（NA），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），麦芽琼脂培养基（MEA）均购自中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限公司。

1.1.4 抑菌剂载体

5 mm直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120℃干燥2 h，保存备用。

1.1.5 厌氧装置

MGC厌氧培养盒及厌氧产气袋AnaeroPack均购自日本三菱瓦斯化学株式会社。

1.2 抑菌能力评价

目前抑菌能力测定的方法有纸片扩散（Kirby-Bauer，KB）法、最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）法、抑菌效力检查法等［3-9］，实验参考《消毒技术规范》（2002版）纸片扩散法［3］。

1.2.1 培养基的制备

按照实验所需剂量称取MHA培养基或MRS琼脂培养基干粉，加蒸馏水搅拌，加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20 min，冷却至50℃倾注平板备用。

1.2.2 实验菌株菌悬液的制备

将10株实验菌株分别在适宜的培养基上活化培养，分别蘸取1～2环生长对数期菌体至1 mL无菌0.85%生理盐水中，涡旋振荡15 s，用麦氏标准比浊管校正菌悬液浓度为0.5 McF，即5×105～5×106CFU/mL。

1.2.3 “生命营养液”抑菌片的制备

取无菌并干燥的滤纸片，每片滴加30 μL“生命营养液”原液，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，置37℃温箱烘干备用。

1.2.4 阴性对照样片的制备

取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水30 μL，干燥后备用。

1.2.5 实验菌的接种

CICC 21513、CICC 21530、CICC 21534、CICC 21600、CICC 21636接种于MHA琼脂培养基，CICC 6009、CICC 6035、CICC 6064、CICC 6069、CICC 21710接种于MRS琼脂培养基，用无菌棉签蘸取实验菌株菌悬液，平板表面均匀涂抹3次，每涂抹1次，平板转动60℃，最后将棉签绕平板边缘涂抹1周。盖好平皿，室温干燥5 min。

1.2.6 “生命营养液”抑菌剂样片贴放

每个平板贴放1片实验样片，1片阴性对照样片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，样片中心之间相距25 mm以上，与平板的周缘相距15 mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面，盖好平皿。实验重复3次。

1.2.7 培养观察测量

5种常见致病菌在MHA培养基上好氧37℃培养1 d，5种常见益生菌在MRS培养基上厌氧37℃培养1～3 d。用游标卡尺测量抑菌环直径（包括贴片）并记录。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行，测量其直径应以抑菌环外沿为界。

1.3 菌种分离与纯化

1.3.1 培养基的配制

按照实验所需剂量称取NA、MRS、PDA、MEA琼脂培养基干粉，加蒸馏水搅拌，同时加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20 min，冷却至50℃倾注平板备用。

1.3.2 菌种分离纯化

在无菌条件下，称取25.0 mL“生命营养液”，放入盛有225.0 mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中，充分振荡20 min，之后静置5 min。采用梯度稀释法制备10-2到10-6的系列稀释液，分别涂布于NA、MRS培养基平板中37℃好氧培养48～72 h，涂布于MEA、PDA培养基平板中25℃好氧培养4 d。挑取单菌落转接至新鲜斜面培养基上培养，并于4℃保藏。

1.3.3 形态学观察

纯化的菌株在适宜培养条件下培养，通过肉眼观察并描述菌落质地、颜色、形状、大小等菌落形态。在光学显微镜下，通过革兰氏染色法观察并描述细菌菌体形态，通过水浸片法观察并描述真菌菌丝、孢子、产孢结构等菌体形态。

2 结果与分析

2.1 抑菌能力评价

参考消毒技术规范（2002版）抑菌环实验［3］，测定抑菌产品对细菌的抑菌作用，样品剂量为“生命营养液”原液30 μL，抑菌环直径＞7 mm者，判为有抑菌作用，抑菌环直径≤7 mm者，判为无抑菌作用。3次实验结果取平均值，实验设阴性对照，抑菌圈直径及判定结果见表2，培养照片见图1。

表2 实验样品对10种细菌的抗（抑）菌实验结果Tab.2 Results of antimicrobial ability for test sample to 10 kinds of bacteria

图1 实验样品对10种细菌的抗（抑）菌实验照片Fig.1 Photos of antimicrobial test for sample to 10 kinds of bacteria

新疆特色功能饮料“生命营养液”对5种常见食源性致病菌肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp.Enterica）、出血性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EHEC O 157：H7）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas eruginosa）均具有较好的抑菌能力，抑菌圈直径分别为10.5，12.0，12.0，12.5，10.0 mm。对4种常见益生菌植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）无抑菌能力，仅对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）具有抑菌能力，抑菌圈直径为27.0 mm。CICC 6035嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）在接菌量同为0.5 McF情况下，生长相对较弱，在平皿上形成细密的单菌落，而其他9株菌生长良好，在平皿上形成成片菌落。

新疆特色功能饮料“生命营养液”的抑菌能力和范围，推测其具有选择性抑菌特性，与其在促进细胞再生、帮助伤口组织愈合方面的功能相关，明确机理需要进一步的研究。

2.2 菌种分离纯化

2.2.1 菌种分离纯化

从“生命营养液”中分离纯化出5种优势菌，包括4种细菌，分别编号为B1、B2、B3、B4；1种真菌，编号为F1。分离情况详见表3。

表3 “生命营养液”微生物菌种分离与纯化Tab.3 Separation and purification of strains in“life nutrient liquid”

2.2.2 菌种形态学观察

2.2.2.1 菌落特征观察

分离菌株B1、B2、B3、B4、F1菌落形态描述见表4，菌落形态照片见图2。

表4 “生命营养液”分离菌株B1、B2、B3、B4、F1菌落形态描述Tab.4 Colony morphology description of strain B1，B2，B3，B4，F1，which were isolated from“life nutrient liquid”

图2 “生命营养液”分离菌株B1、B2、B3、B4、F1菌落形态Fig.2 Colony morphology of strains B1，B2，B3，B4，F1，which were isolated from“life nutrient liquid”

2.2.2.2 菌体特征观察

分离得到的菌株B1、B2、B3、B4、F1菌体形态描述见表5，菌体形态照片见图3。

表5 菌株B1、B2、B3、B4、F1菌体形态Tab.5 Cell morphology of strain B1，B2，B3，B4，F1

图3 “生命营养液”分离菌株B1、B2、B3、B4、F1菌体形态Fig.3 Microscopy morphology of strains B1，B2，B3，B4，F1，which were isolated from“life nutrient liquid”

菌株B1、B2、B3革兰氏染色红色，为革兰氏阴性杆状细菌，菌株B4革兰氏染色紫红色，为革兰氏阳性杆状细菌，需要进一步的多相鉴定到种水平。菌株F1菌落粉红色，丝绒状，表面平坦，产可溶性红褐色色素丝状真菌；无性生殖分生孢子单生或链生，着生在菌丝顶端，倒梨形至近球形，菌丝有横隔；有性生殖闭囊壳球形，成熟后壳壁透明。其与红曲菌属菌丝形态、无性世代及有性世代特征符合，初步鉴定为红曲菌属（Monascus sp.）。

3 讨 论

在全球抗生素类药物耐药性问题日益突出的背景下［10-11］，抗生素滥用的控制越来越受到重视，开发新型天然抑菌功能类产品显得尤为迫切。文献报道［12-15］，多种食品及饮料如橄榄油、醋、茶、牛奶等含有的天然物质中，均具有抑制常见食源性致病菌的活性成分，如茶多酚、乳烃素等，这些含有活性成分并具有一定保健功能的食品和饮料，在人体保健养生方面起到积极的辅助作用。推测新疆特色功能饮料“生命营养液”也含有类似的天然抑菌活性成分，并具有选择性抑菌特性，使其在促进组织伤口愈合、抑制细胞增值等方面具有辅助治疗及保健功能［2］，课题组对海南西沙诺尼（Noni）发酵果汁也进行了抑菌能力评价，具有类似的抑菌效果。因此，开发具有天然抑菌功效的发酵果蔬汁产品，具有广阔的应用前景。

“生命营养液”为天然果蔬发酵而成，原料和环境中的自然菌株参与了发酵过程，初步推测其抑菌活性成分为微生物发酵代谢产物或微生物本身，抑菌活性成分可能与其代谢产生的有机酸、多酚、黄酮、多糖等相关。目前认为抑制细菌繁殖的可能机制有：抑制细胞膜合成；抑制蛋白质合成；干扰DNA的复制与转录；阻断微生物代谢等［16］。“生命营养液”抑菌活性成分分析及抑菌机理的确认需要进一步深入研究。

“生命营养液”自然发酵过程使其本身带有多种活菌，产品菌落总数2.8×104CFU/mL，在一定程度上影响饮品的口感及功能，因此分析微生物菌群优势微生物种类显得尤为重要，实验通过培养法初步分离了5种优势微生物，其中F1初步鉴定为红曲菌属（Monascus sp.），红曲菌是我国食品中传统使用的真菌，后续需要对这5种微生物进行多相分类鉴定，获得准确的种水平分类地位，进而分析其对饮品功能性的影响。同时，批次产品间的抑菌性能稳定性需要评估，生产工艺需要进一步标准化，实验样品量需进一步扩大。

［1］亚森·克力木.一种保健营养液及其制备方法：中国，201110111492.8［P］.2011-11-02.

［2］新疆埃杜升生物开发有限公司.埃杜升生命营养液［EB/OL］.［2014-06-01］http：∥www.aldost.com/cn/ product_show.php？id=1.

［3］中华人民共和国卫生部.消毒技术规范2002—2.1.8. 2抑菌环试验［S］.北京：中国标准出版社，2002.

［4］中华人民共和国卫生部.WS/T 125—1999纸片法抗菌药物敏感试验标准［S］.北京：中国标准出版社，1999.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1944—2007动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法［S］.北京：中国标准出版社，2007.

［6］Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI M38-A2-2008 reference method for broth dilution antifungal susceptibilitytestingoffilamentousfungi，approved standard-second edition［S］.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［7］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；twentyfirst informational supplement CLSI document M100-S21-2011［S］.Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2011.

［8］国家药典委员会.中华人民共和国药典-二部附录XIX N：抑菌剂效力检查法指导原则［M］.9版.北京：中国医药科技出版社，2010：215-216.

［9］Food and Agriculture Organization and World Health Or-ganization Expert Committee on Food Additives.Combined compendium of food additive specifications volume 4，analytical methods，test procedures and laboratory solution used by and referenced in the food additive specifications［M］.Rome：Food and Agriculture Organization of the United Nations，2006：22-24.

［10］Center for Disease Control and Prevention.About antimicrobial resistance：a brief overview［EB/OL］.［2014-06-01］http：∥www.cdc.gov/drugresistance/about.html.

［11］World Health Organization.Antimicrobial resistance global report on surveillance［R］.Geneva：WHO，2014.

［12］Medina E，Romero C，Brenes M，et al.Antimicrobial activity of olive oil，vinegar，and various beverages against foodborne pathogens［J］.Journal of Food Protection，2007，70（5）：1194-1199.

［13］Eric W C，Eu Y S，Pei P T，et al.Antioxidant and antibacterial properties of green，black，and herbal teas of Camellia sinensis［J］.Pharmacognosy Research，2011，3（4）：266-272.

［14］Bandyopadhyay D，Chatterjee T K，Dasgupta A，et al. In vitro and vivo antimicrobial action of tea：the commonest beverage of Asia［J］.Biological&Pharmaceutical Bulletin，2005，28（11）：2125-2127.

［15］Pinaperez M C，Rodrigo D，Martinezlopez A.Antimicrobial potential of flavoring ingredients against Bacillus cereus in a milk-based beverage［J］.Foodborne Pathogens and Disease，2013，10（11）：969-976.

［16］Tenover F C.Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria［J］.The American Journal of Medicine，2006，119（6）：3-10.

Evaluation of Antimicrobial Ability and Isolation of Strains from Xinjiang“Life Nutrient Liquid”

ZHAO Ting1， UBUL·Kadir2， ZHAI Lei1， BAI Feirong1， CHENG Chi1，*
（1.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015，China；（2.Xinjiang ALDOS Biological Development Co.Ltd.，Urumqi 830000，China）

Evaluation of antimicrobial ability of Xinjiang unique functional beverage“life nutrient liquid”on five kinds of common food-borne pathogenic bacteria and 5 kinds of common probiotics in food industry.At the same time，microbe strains were separated and purified from this functional beverage.Results showed 30 μL“life nutrient liquid”had antibacterial property for all 5 kinds of pathogenic bacteria：Salmonella enterica subsp.Enterica，Escherichia coli EHEC O157：H7，Shigella flexneri，Staphylococcus aureus，and Pseudomonas eruginosa，and the inhibitory zone diameters were 10.5 mm，12.0 mm，12.0 mm，12.5 mm，and 10.0 mm，respectively.For 4 kinds of probiotics：Lactobacillus plantarum subsp. Plantarum，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，Bifidobacterium infantis，and Bifidobacterium animalis subsp.lactis，the beverage has no obvious antibacterial properties except Streptococcus thermophilus，which the inhibitory zone diameter was 27.0 mm.Three different gram-negative rod-shaped bacteria，a gram-positive rod-shaped bacterium and a fungus which produced reddish brown soluble pigment were isolated from the beverage.The fungus was preliminary identified as Monascus sp.The test results provided a basic reference data for the systematically functional research of Xinjiang unique functional beverage“life nutrient liquid”.

antimicrobial ability；separation and purification；Xinjiang；functional beverage

李 宁）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.009

2095-6002（2015）02-0048-06

赵婷，吾布利·卡地尔，翟磊，等.新疆“生命营养液”抑菌能力评价及其菌种分离纯化［J］.食品科学技术学报，2015，33（2）：48-53.

ZHAO Ting，UBUL·Kadir，ZHAI Lei，et al.Evaluation of antimicrobial ability and isolation of strains from Xinjiang“life nutrient liquid”［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：48-53.

2014-06-11

国家科技支撑计划项目（2012BAK17B11）。

赵 婷，女，高级工程师，硕士，主要从事微生物菌种鉴定与评价方面的研究；

*程 池，男，教授级高级工程师，主要从事微生物学方面的研究。

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