正交试验优选通窍活血胶囊水提工艺

雷晓翠　安红伟　顿玲露　赵世亮　徐榛　王少洲

【摘要】目的：优选通窍活血胶囊的最佳提取工艺。方法：以芍药苷含量和干膏率为评价指标，利用正交试验考察加水量、提取时间、提取次数对通窍活血胶囊提取工艺的影响，采用HPLC法测定芍药苷的含量。结果：最佳提取工艺为加12倍量水提取3次，每次30min；芍药苷含量为21.10mg/g，干膏率为23.42%。结论：优选的提取工艺稳定可行，为通窍活血胶囊的合理开发提供参考。

【关键词】通窍活血胶囊；正交试验；芍药苷

【中图分类号】R284.2【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2015）20-0006-03

OptimizationofExtractionTechnologyforTongqiaohuoxueCapsulebyOrthogonalTest

LeiXiaocui1AnHongwei1*DunLinglu1ZhaoShiliang2XuZhen2WangShaozhou2

1.LiuzhoutraditionalChineseMedicalHospital，GuangxiLiuzhou545001，China；

2.GuangxiUniversityofChineseMedicine，GuangxiNanning530001，China

Abstract：ObjectiveTooptimizetheextractiontechnologyforTongqiaohuoxueCapsule.MethodTheextractionconditionswereoptimizedbyorthogonaltest，withthesolventvolume，extractiontimeandextractiontimesastheinfluencingfactors，thecontentofthePaeoniflorinandtheyieldofdryextractwereusedastheevaluationindexes.ThecontentofpaeoniflorinwasdetectedbyHPLCmethod.ResultTheoptimalextractionconditionswere：refluxingextractionfor3timesand30mineachtimewith12foldamountofwater.Thecontentofthepaeoniflorinwas21.10mg/gandtheyieldofdryextractwas23.42%.ConclusionTheextractiontechnologyisreasonable，reliable，andprovidesafoundationforthefurtherproductionandqualitycontrolofTongqiaohuoxueCapsule.

Keywords：TongqiaohuoxueCapsule；Orthogonaltest；paeoniflorin

通窍活血胶囊是由赤芍、川芎、桃仁、红花、红枣、鲜姜、老葱、麝香等多味中药组成的制剂，具有活血化瘀，通窍活络的作用。药理研究发现，通窍活血胶囊可以改善脑组织的病理学损伤、保护脑组织抗氧化酶的活性、减轻氧自由基对脑组织的损伤[1]，并减轻微循环障碍[2]。为了合理制定通窍活血颊囊的提取工艺，研究根据处方中药物有效成分的理化性质和药理作用，结合中医临床用药的特点，采用正交试验法对通窍活血胶囊的提取工艺进行研究，现报告如下。

1仪器与试药

1.1仪器LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（上海美析仪器有限公司）；MS204-S电子天平（梅特勒-托利多）；VP-1400H型真空泵（东莞市普立真空设备有限公司）；DHG-9140A型电热鼓风干燥箱（上海越众仪器设备有限公司）；YZ-180DB型超声波清洗仪（上海越众仪器设备有限公司）；S.HH.W21.600S型数显式三用电热恒温水浴箱（上海跃进医疗仪器有限公司）。

1.2试剂与试药芍药苷对照品（批号：110736-201438，中国药品生物制品检定所）；赤芍芍等饮片购于国药控股广西中药饮片有限公司。乙腈（批号：141175，美国Fisher）、甲醇（批号：140400，美国Fisher）为色谱纯；水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1正交试验设计本方临床以汤剂形式应用，且方中药材主要有效成分多为皂苷和多糖类成分，均有较好的水溶性，所以本实验采用水煎煮法提取。以处方中赤芍所含的有效成分芍药苷的含量及干膏得率为评价指标，并按以上两指标的权重系数分别为80%和20%进行综合加权评分[3]。采用L9（34）正交试验对加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）进行优选。因素水平见表1。

表1正交试验因素水平表

2.2干膏得率测定精密吸取正交试验浓缩液10ml，置于已恒重的干燥蒸发皿中水浴蒸干后，置于105℃烘箱中干燥至恒重，迅速置于干燥器放冷，称重，计算得膏率。

2.3芍药苷含量测定

2.3.1色谱条件DiamonsilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（14：86）[4]；流速：1ml/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：l0μl。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，分离度应不低于1.5[5]。

2.3.2对照品溶液的制备精密称取在芍药苷对照品3.10mg，置10ml容量瓶中，加适量甲醇溶解，再加甲醇至刻度制成浓度为0.31mg/ml的对照品溶液，摇匀，备用。

2.3.3供试品溶液的制备按处方量精密称取处方中各味中药（麝香、黄酒除外），按照正交试验设计的因素参数进行试验，提取，过滤，合并滤液，浓缩至1∶1，精密吸取浓缩液1ml置蒸发皿中，水浴蒸干，加适量甲醇溶解过滤至25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，备用。

2.3.4阴性对照液的制备制备缺白芍药材的提取液，按“2.3.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3.5线性关系考察分别取“2.3.2”项下对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml置于10ml溶量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取上述各对照品溶液10μl，按上述色谱条件注入液相色谱仪进行测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y=36472X-91686（R2=0.9948，n=6）。表明芍药苷在6.20～37.1μg范围呈良好线性关系。

2.3.6阴性样品干扰考察精密吸取阴性对照溶液10μl注入液相色谱仪，发现在与芍药苷对照品出峰的相应位置上，阴性供试品无相应色谱峰出现，说明样品中的其他成分不干扰芍药苷的测定。图谱见图1。

2.3.7含量测定分别精密吸取“2.3.2”项下的对照品溶液与“2.3.3”项下的供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，测定芍药苷的含量。对照品、供试品及阴性对照图谱见图1。

2.4正交试验结果按L9（34）正交试验表进行试验，结果见表2、表3。

表2水提工艺正交试验结果

注：综合评分=（得膏率/最大得膏率）×100×0.2+（芍药苷含量/最大芍药苷含量）×100×0.8

表3方差分析结果

由表2、表3可知：影响提取效果的因素大小顺序为：C>A>B，即提取次数>加水量>提取时间，加水量（A）和提取次数（C）有显著影响，且C3>C2>C1，A3>A2>A1，B2>B3>B1。由于提取时间对结果没有显著性影响，故选择提取时间为30min，最佳工艺为A3B1C3，即加12倍量水提取3次每次30min。

2.5验证试验为进一步验证优选工艺的可靠性，分别取3份按处方比例混合的药材，按照优选的最佳条件进行试验，结果表明，优选的提取工艺切实可行。见表4。

表4水提工艺验证试验结果

3讨论

3.1指标参数的确定通窍活血胶囊含有多味中药，成分较为复杂，故选择干膏率作为考察指标之一。芍药苷为方中赤芍的主要活性物质之一，是一种潜在的神经保护药。研究发现芍药苷能通过减少脑组织自由基的产生、抑制脂质过氧化反应、抑制内源性神经肽内皮素的产生，从而对沙土鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用[6]；通过提高机体消除自由基能力和增加Nrf2表达来减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后自由基引起的氧化损伤作用，从而对缺血性脑组织起到脑保护作用[7]，故选择芍药苷作为另一考察指标。

3.2评分方法试验设定了芍药苷含量和干膏率两个考察指标，故采用综合加权评分法，可以兼顾各项指标，以各试验综合得分评价试验结果，可化多指标为单指标进行分析，简单方便。

3.3指标权重系数的确定多指标成分综合评价优选中药提取工艺，应该结合各指标成分对试验结果的影响来确定指标成分在综合加权评分法中的权重系数。根据试验的目的，处方中指标性成分芍药苷的含量对提工艺的影响更重要，故评分时设定干膏率和芍药苷含量的权重分别占综合评分的20%和80%，以优选出更具科学性和合理性的提取工艺[8]。

3.4HPLC流动相的确定实验在选择流动相时，参照《中国药典》赤芍项下的芍药苷含量测定方法，经过数次的试验，其中包括改变流动相组成：分别尝试以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液，甲醇-0.05%磷酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行洗脱；改变流动相比例：对乙腈-0.1%磷酸溶液的比例18：82、17：83、16：84、15：85、14：86、13：87进行比较，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）为最佳洗脱条件，此时的峰形较好，分离度大于0.5，理论塔板数大于3000。所以实验选取乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）为流动相。

3.5提取工艺的确定通过对干膏率和芍药苷含量综合加权评分的分析，确定其最佳提取工艺为以12倍量水提取3次，每次30min。并以此工艺进行3批验证试验，两项指标重复性好（RSD%<2%），表明优选的提取工艺稳定可行、提取简便、易于操作，符合生产的要求。参考文献

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（收稿日期：2015.07.06）