除湿止痒软膏抗炎及止痒作用研究

曾怡 史梦琪 杨欢 何萍 王有为 杜俊蓉

·论著·

除湿止痒软膏抗炎及止痒作用研究

曾怡 史梦琪 杨欢 何萍 王有为 杜俊蓉

目的 探讨除湿止痒软膏的抗炎及止痒作用。方法 用2，4-二硝基氟苯（DNFB）腹部致敏和背部反复激发建立BALB/c小鼠特应性皮炎模型。实验动物分为正常对照组（未致敏也未治疗）、模型对照组（致敏但未治疗）、氢化可的松乳膏组（致敏+氢化可的松）、除湿止痒软膏组（致敏+除湿止痒软膏）。连续用药14 d，末次给药12 h后取背部皮肤，测定皮肤厚度及质量，进行HE染色和甲苯胺蓝染色，ELISA法检测皮损组织中干扰素（IFN）γ、肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-4、IL-5含量。利用磷酸组胺诱发Hartley豚鼠局部皮肤瘙痒模型，观察除湿止痒软膏对豚鼠致痒阈的影响。结果 用药后第15天，与模型对照组相比，氢化可的松乳膏和除湿止痒软膏均可明显减少小鼠的背部皮肤厚度和质量（P<0.01），减少淋巴细胞和肥大细胞浸润（P<0.01）以及降低皮损组织中IFN-γ、TNF-α、IL-4及IL-5水平（P<0.05或P<0.01）。与正常对照组相比，氢化可的松乳膏组小鼠背部皮肤厚度和质量减小（P<0.01），除湿止痒软膏组无明显变化。此外，除湿止痒软膏也可显著提高豚鼠耐受磷酸组胺的致痒阈（P<0.01）。结论 除湿止痒软膏可明显抑制DNFB引起的小鼠特应性皮炎，其抗炎机制可能与恢复体内Th1/Th2型细胞因子平衡有关。除湿止痒软膏可明显减轻磷酸组胺所致豚鼠皮肤瘙痒反应。

皮炎，特应性；抗炎药（中药）；止痒药；组胺；除湿止痒软膏

作者单位：610041成都，四川大学华西药学院药理系（曾怡、史梦琪、杨欢、何萍、杜俊蓉）；四川省医学科学院、四川省人民医院皮肤病性病研究所（王有为）

目前临床上治疗特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）以外用糖皮质激素和口服抗组胺药为主，长期使用不良反应明显。除湿止痒软膏由蛇床子、苦参、黄连、黄柏、白鲜皮、虎杖、紫花地丁、地肤子、萹蓄、茵陈、苍术、花椒、冰片十三味中药组成，有清热除湿、祛风止痒功效，临床上已用于治疗湿疹［1-2］。本实验通过2，4-二硝基氟苯（DNFB）诱导小鼠AD模型和磷酸组胺诱发豚鼠局部瘙痒模型，评价除湿止痒软膏的抗炎及止痒作用。

资料与方法

一、材料

1.实验动物：Hartley豚鼠24只，雌雄各半，体重（222.6±26.1）g，由成都彭县养殖场提供，合格证号0007476。SPF级8周龄BALB/c雄鼠40只，体重（22.9±1.5）g，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号0003282。

2.实验药品：除湿止痒软膏（规格0.777 g生药/g膏，成都明日制药有限公司，批号140803）；氢化可的松乳膏（10 g∶10 mg，天津金耀药业有限公司，批号 12041337）；赛庚啶乳膏（10 g∶50 mg，湖南五洲通药业有限责任公司，批号130630）；DNFB（成都格雷西亚化学技术有限公司，批号D16877），溶于丙酮橄榄油溶液（4∶1）中配成0.15%DNFB溶液；磷酸组胺（成都科龙化工试剂厂，批号201312）；Na2S·9H2O（成都市科龙化工试剂厂，批号20130844），脱毛剂配方：8 g Na2S·9H2O用温水60 ml溶解后，加入40 ml 75%乙醇配制而成。

3.主要试剂及设备：小鼠IL-5ELISA试剂盒（美国RB公司），小鼠IL-4、小鼠IFN-γ、小鼠TNF-α ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；外径千分尺（青海量具刃具有限责任公司），全波长多功能酶标仪（美国ThermoFisher公司）。

二、小鼠 AD 模型实验［3-4］

1.实验分组及小鼠AD模型建立：将40只BALB/c小鼠按体重分为正常对照组、模型对照组、氢化可的松乳膏组、除湿止痒软膏组，每组10只。实验前1天均剃除并脱去小鼠腹部毛发，面积约2 cm×3 cm；第1天，实验组小鼠均于腹部脱毛处外涂100μl 0.15%DNFB致敏，正常对照组外涂100 μl丙酮橄榄油溶液；第3天均剃除并脱去小鼠背部毛发，面积约2 cm×3 cm；第7天，实验组小鼠于背部脱毛处涂100 μl 0.15%DNFB激发，正常对照组外涂100 μl丙酮橄榄油溶液，每周激发2次，连续4周。共激发9次。

2.给药方案：造模成功24 h后开始给药，给药时程为14 d。除湿止痒软膏每天3次（9：00/15：00/21：00），每次 0.04 g；氢化可的松乳膏每天 2 次（9：00/21：00），每次0.04 g；模型对照组和正常对照组同时给予100 μl生理氯化钠液，每天3次。用药第8天给予100 μl 0.15%DNFB进行第10次激发。

3.观察指标：末次给药12 h后，小鼠断颈处死并作以下处理：①选取小鼠背部皮肤3个不同固定部位，用8 mm金属打孔器打孔，去除皮下脂肪组织后立即用外径千分尺测量厚度，分析天平称重；②背部皮肤标本制成10%组织匀浆，ELISA法测定上清液中 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5含量，以 1 g/L 匀浆组织中细胞因子含量作为相对细胞因子含量［5］；③背部皮肤标本4%甲醛固定、石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺蓝染色，高倍镜（×400）下取10个HE染色切片无重叠视野计数淋巴细胞，100倍镜下取5个甲苯胺蓝染色切片无重叠视野计数肥大细胞。

三、局部瘙痒模型实验［6］

将24只Hartley豚鼠按体重随机分为模型对照组、赛庚啶乳膏组、除湿止痒软膏组，每组8只。实验前1天将豚鼠右后足背剪毛并脱毛，面积约1 cm×1 cm，并在脱毛处涂药1次，0.03 g/只。实验当日将脱毛处皮肤用细砂纸轻轻擦伤，使之发红，但以不出血为度，再给药1次。10 min后开始在创面处滴0.01%磷酸组胺溶液，以后每隔3 min以0.02%、0.03%、0.04%……递增浓度，每次 30 μl，直至豚鼠回头舔右后足，以此时给予的磷酸组胺总量为致痒阈，比较各组致痒阈差异。

四、统计学方法

结 果

一、药物对各组小鼠皮肤厚度及质量的影响

用药后第15天，氢化可的松乳膏组皮肤萎缩，皮肤厚度和质量均减小，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。除湿止痒软膏组小鼠皮肤质量和厚度均已恢复至正常，与正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

二、药物对各组小鼠皮肤组织结构的影响

小鼠AD模型建立后，背部皮肤出现增厚、红斑、水肿、厚痂（图1A）。用药后第7天，模型对照组部分痂皮脱落，有鳞屑、中度红斑及水肿（图1B）；氢化可的松软膏组背部有轻度红斑，水肿消去（图1C）；除湿止痒软膏组仍有轻度红斑及水肿，无明显痂皮（图1D）。用药后第15天，模型对照组背部皮损程度（图1F）基本同第7天，HE染色可见表皮突下延，表皮细胞中度水肿，棘层、颗粒层肥厚，角化过度伴角化不全；真皮层大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主（图2B），可见肥大细胞。氢化可的松乳膏组红斑水肿消失，皮肤变薄皱缩（图1G），真皮层细胞层数减少，与模型对照相比，淋巴细胞（图2C）和肥大细胞浸润均减轻（P＜0.01）。除湿止痒软膏组轻度红斑，水肿消失，表皮增厚不明显（图1H），与模型对照相比，真皮层淋巴细胞（图2D）和肥大细胞浸润均减轻（P＜0.01）。淋巴细胞和肥大细胞计数结果见表1。

三、药物对各组小鼠皮损组织匀浆细胞因子水平的影响

与正常对照组相比，模型对照组 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5 水平均升高，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；氢化可的松乳膏和除湿止痒软膏组4类细胞因子恢复正常，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型对照组相比，氢化可的松乳膏和除湿止痒软膏均可明显抑制这4类细胞因子水平升高（P＜0.01或P＜0.05），且氢化可的松乳膏对TNF-α抑制作用强于除湿止痒软膏（P＜0.05）。见表2。

表1 用药后第15天对特应性皮炎小鼠皮肤质量及厚度、皮损淋巴细胞及肥大细胞的影响（±s）

表1 用药后第15天对特应性皮炎小鼠皮肤质量及厚度、皮损淋巴细胞及肥大细胞的影响（±s）

注：组间多重比较，a：与正常对照组相比，P＜0.01；b：与模型对照组相比，P＜0.01

组别 只数正常对照组 10模型对照组 10氢化可的松乳膏组 10除湿止痒软膏组 10 F 药物（P 值）F 区组（P 值）肥大细胞（个/mm2）23.04±1.11 0.677±0.025 128.3±17.2 7.5±0.6 39.06±1.90a 1.073±0.040a 488.6±43.8a 42.9±1.1a 13.52±0.44ab 0.293±0.011ab 205.6±11.4ab 18.7±2.5ab 25.02±1.25b 0.748±0.036b 252.9±13.7ab 22.8±2.5ab 66.040（0.000） 108.189（0.000） 25.763（0.000） 50.808（0.000）0.932（0.660） 0.845（0.626） 0.782（0.684） 1.580（0.160）皮肤质量（mg）皮肤厚度（mm）淋巴细胞（个/mm2）

表2 用药后第15天对特应性皮炎小鼠组织匀浆相对细胞因子含量的影响（±s） ng/L

表2 用药后第15天对特应性皮炎小鼠组织匀浆相对细胞因子含量的影响（±s） ng/L

注：a：与正常对照组相比，P ＜ 0.05；b：与正常对照组相比，P ＜ 0.01；c：与模型对照组相比，P ＜ 0.01；d：与模型对照组相比，P ＜ 0.05；e：与氢化可的松乳膏相比，P ＜ 0.05

干扰素γ 肿瘤坏死因子α 白细胞介素4 白细胞介素5 22.98±3.39 332.03±52.59 44.48±5.86 10.58±1.58 57.22±9.09a 617.25±48.45b 77.62±5.96b 14.84±1.12a 17.26±2.38c 255.48±64.65c 38.40±10.74d 8.03±1.01c 25.96±2.68d 415.11±49.01de 52.05±2.09c 9.77±0.58c 6.470（0.003） 6.899（0.002） 4.741（0.007） 5.599（0.003）0.806（0.655） 0.911（0.589） 0.560（0.885） 1.052（0.430）组别 只数正常对照组 10模型对照组 10氢化可的松乳膏组 10除湿止痒软膏组 10 F 药物（P 值）F 区组（P 值）

图1 小鼠特应性皮炎模型皮损及用药后第7、15天各组小鼠皮损情况 1A：建模后小鼠背部出现增厚、潮红、水肿、厚痂；1B：模型对照组第7天痂皮脱落，有鳞屑，中度红斑及水肿；1C：氢化可的松乳膏组第7天小鼠背部有轻度红斑，水肿消去；1D：除湿止痒软膏组第7天仍有轻度红斑及水肿，无明显痂皮；1E：正常对照组第15天；1F：模型对照组第15天背部皮损程度基本同第7天；1G：氢化可的松乳膏组第15天红斑水肿消失，皮肤变薄皱缩；1H：除湿止痒软膏组第15天轻度红斑，水肿消失，表皮增厚不明显

图2 用药后第15天各组小鼠皮损HE染色（×100） 2A：正常对照组；2B：模型对照组表皮增厚明显，大量炎症细胞浸润；2C：氢化可的松乳膏组炎症细胞浸润减少；2D：除湿止痒软膏组炎症细胞浸润减少

四、药物对磷酸组胺诱发豚鼠局部瘙痒的影响

与模型对照组相比，除湿止痒软膏和赛庚啶乳膏均可明显提高豚鼠耐受磷酸组胺的致痒阈（P<0.01或P<0.05）。见表3。

表3 除湿止痒软膏对磷酸组胺所致豚鼠瘙痒反应的影响（±s）

表3 除湿止痒软膏对磷酸组胺所致豚鼠瘙痒反应的影响（±s）

注：与模型对照组相比，a：P<0.05；b：P<0.01

组别 只数模型对照组 8赛庚啶乳膏组 8除湿止痒软膏组 8 F 药物（P 值）F 区组（P 值）致痒阈（μg） 涂抹次数21.3±6.5 2.9±0.5 134.3±50.6a 7.5±1.4a 201.3±44.2b 9.8±1.3b 4.895（0.022） 7.820（0.004）0.374（0.931） 0.379（0.929）

讨 论

中医认为AD是先天禀性不耐而素体热耐；或后天脾失健运或营血不足，复感风湿热邪，风燥湿热郁结于肌肤而发病［7］。近年来，Th1/Th2失衡学说成为该病发病机制研究热点。一般认为急性阶段以Th2型免疫反应为主，细胞因子如IL-4、IL-5表达增加，随着病程发展，逐渐转以Th1型免疫反应为主，且搔抓可诱导这一过程的转化［8-9］。抗原种类，接触剂量、频率、剂量和途径等均可影响Th1/Th2平衡偏倚方向［10］。本研究建立的小鼠AD模型具有潮红、结痂和鳞屑、肥厚、苔藓化、浸润等特点，被认为处于亚急性阶段。AD模型对照组皮损组织IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5 水平均增加，呈现 Th1、Th2 混合型变态反应，与已有文献［4］结果一致。有文献［2］报道，该模型细胞因子表达呈Th2优势型，我们认为可能与本实验中使用的DNFB激发剂量更大有关。用药后第15天后，除湿止痒软膏和氢化可的松乳膏均可明显减轻小鼠的皮肤水肿和炎症细胞浸润，不同程度恢复皮损组织中上述4类细胞因子水平，提示其抗炎作用可能与纠正Th1/Th2平衡相关。与氢化可的松乳膏不同的是，除湿止痒软膏并未引起皮肤萎缩，且对TNF-α抑制作用弱于氢化可的松乳膏。对TNF-α抑制作用的差异可能是两种药物治疗强度不同的原因之一，其具体机制有待进一步探讨。

瘙痒是各类皮炎湿疹的一个重要特征，也是影响患者生活质量的关键所在。组胺是最早发现的瘙痒介质之一。在小鼠AD模型中，除湿止痒软膏可减少皮损组织肥大细胞浸润，提示该药还可能抑制组胺释放。因此，本实验建立外源性磷酸组胺诱发豚鼠局部瘙痒模型，结果证实除湿止痒软膏确可显著抑制磷酸组胺所致豚鼠皮肤的局部瘙痒。

本文结果表明，除湿止痒软膏对DNFB诱导小鼠AD模型及磷酸组胺诱导豚鼠局部瘙痒模型具有良好的治疗作用，值得进一步分析其抗炎止痒有效成分、考察量效关系，进而优化配方及开发新剂型，以发挥更大的临床应用价值。

声明 本研究由成都明日制药有限公司资助

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本刊2016年重点号征稿启事

2016年《中华皮肤科杂志》初步计划组织免疫性皮肤病重点号（第1期），银屑病重点号（第4期），性传播疾病重点号（第5期），真菌病专刊（第8期），设述评、专家论坛、专家笔谈、指南与共识、论著、综述、病例报告、来信、临床病例诊治经验及讨论等栏目，特向全国各医院皮肤性病科及相关学科临床及科研人员征稿，各栏目文稿要求见本刊稿约。欢迎投稿。

Anti-inflammatory and antipruritic effects ofChushizhiyangointment

Zeng Yi*,Shi Mengqi,Yang Huan,He Ping,Wang Youwei,Du Junrong.*Department of Pharmacology,West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China

ObjectiveTo explore the anti-inflammatory and antipruritic effects ofChushizhiyangointment in a mouse model.MethodsA total of 40 male 8-week-old BALB/c mice were included in this study,and randomly and equally divided into 4 groups.A mouse model of atopic dermatitis（AD）was established in three groups of mice by repeated application of 2,4-dinitroflurobenzene（DNFB）to shaved abdominal skin for sensitization and to shaved dorsal skin for stimulation.After establishment of the AD model,the three groups were topically treated with sodium chloride physiological solution （model group）,hydrocortisone cream （hydrocortisone group）andChushizhiyangointment（Chushizhiyanggroup）respectively for 14 consecutive days.The remaining group receiving no sensitization or treatment served as the normal control group.All the mice were sacrificed 12 hours after the final treatment,and the dorsal skin of mice was resected followed by the determination of skin thickness and weight as well as hematoxylin-eosin（HE）staining and toluidine blue staining for the counting of leukocytes and mast cells respectively.Moreover,enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to measure the levels of interferon-gamma（IFN-γ）,tumor necrosis factor alpha（TNF-α）,interleukin 4（IL-4）and IL-5 in dorsal skin lesions.In addition,a local skin itching model was induced by histamine phosphate in Hartley guinea pigs,which was used to explore the effect ofChushizhiyangointment on itch thresholds.ResultsCompared with the model group,both theChushizhiyanggroup and hydrocortisone group showed reduced thickness and weight of dorsal skin in mice （allP<0.01）,numbers of infiltrating lymphocytes and mast cells（allP<0.01）and levels of IFN-γ,TNF-α,IL-4 and IL-5 in skin lesions （P<0.05 or 0.01）on day 15 after the start of treatment.The thickness and weight of dorsal skin in mice were significantly decreased in the hydrocortisone group（P<0.01）,but experienced no significant changes in theChushizhiyanggroup compared with the normal control group.Additionally,Chushizhiyangointment could significantly increase itch thresholds in guinea pigs induced by histamine phosphate（P<0.01）.ConclusionsChushizhiyangointment can significantly inhibit DNFB-induced AD in mice,likely by restoring the balance between Th1 and Th2 type cytokines.Moreover,Chushizhiyangointment could markedly relieve itching induced by histamine phosphate in guinea pigs.

Dermatitis,atopic;Anti-inflammatory drugs （TCD）;Antipruritics;Histamine;Chushizhiyang ointment

s:Wang Youwei,Email:wangyouwei2000@163.com;Du Junrong,Email:dujr_1@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.011

王有为，Email：wangyouwei2000@163.com；杜俊蓉，Email：dujr_1@163.com

2015-02-12）

（本文编辑：吴晓初）