窄谱中波紫外线对特应性皮炎患者外周血血清胸腺基质淋巴细胞生成素、白细胞介素25及其受体的影响

李玉娟 江勇 李慧卿 王秀敏

·论著·

窄谱中波紫外线对特应性皮炎患者外周血血清胸腺基质淋巴细胞生成素、白细胞介素25及其受体的影响

李玉娟 江勇 李慧卿 王秀敏

目的 探讨窄谱中波紫外线（NB-UVB）对特应性皮炎（AD）患者血清胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、白细胞介素 25（IL-25）及外周血单一核细胞（PBMC）TSLP受体（TSLPR）mRNA、IL-25受体（IL-25R）mRNA表达水平的影响。方法 AD患者40例，采用NB-UVB照射治疗，双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测治疗前后血清中TSLP、IL-25水平；反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测治疗前后PBMC TSLPR mRNA、IL-25R mRNA的表达水平。采用欧洲的AD评分标准（SCORAD）评估疾病严重程度，视觉模拟标尺法（VAS）评价瘙痒程度。选取30例健康体检者作为对照。组间比较采用两独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验。结果 患者组经NB-UVB照射后总有效率达75%（30/40），治疗后SCORAD评分（20.36±5.12）及VAS评分（3.05±1.02）均较治疗前（分别为55.26±10.88和8.20±1.37）明显降低，差异均有统计学意义（t值分别为 10.29和 8.16，P＜0.05）。AD 患者组治疗前血清 TSLP［（198.24±29.47）ng/L］、IL-25含量（160.54±34.89 ng/L）及 TSLPR mRNA（8.57±1.34）、IL-25R mRNA（6.81±0.50）相对表达量均明显高于健康对照组［分别为（120.13±19.65）ng/L、（120.41±43.07）ng/L、1.94±0.39、1.48±0.47］，差异均有统计学意义（t值分别为 29.70、14.65、7.07、18.89，P ＜ 0.05）。NB-UVB 治疗显著改善病情后，患者血清 TSLP［（151.87 ± 14.78）ng/L］、IL-25 含量［（130.52 ± 29.65）ng/L］及 PBMC TSLPR mRNA（2.89 ± 0.53）、IL-25R mRNA（3.90 ± 0.37）相对表达量较治疗前明显降低，差异均有统计学意义（t值分别为18.56、9.07、5.21、7.35，均P＜0.05）。治疗后血清TSLP、IL-25含量，PBMC TSLPR mRNA、IL-25R mRNA相对表达量与健康对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 TSLP、IL-25可能在AD的发病中起重要作用，NB-UVB下调TSLP、IL-25及其受体的表达可能是NB-UVB治疗AD的机制之一。

皮炎，特应性；紫外线；胸腺基质淋巴细胞生成素；白细胞介素25

以往的研究表明，Th1/Th2细胞平衡失调在特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）发生中起重要作用，急性期Th2细胞占优势，Th1细胞受抑制。近年来发现，上皮细胞衍生的细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白细胞介素25（IL-25）均为Th2型细胞因子，可促进Th2型免疫应答［1］。窄谱中波紫外线（NB-UVB）治疗 AD 有较好疗效［2］，但其作用机制尚不明确。本实验通过检测AD患者NB-UVB治疗前后TSLP、IL-25及其受体的变化情况，探讨NB-UVB治疗AD的机制。

资料与方法

一、临床资料

选取我院门诊40例AD患者，符合Williams诊断标准［3］，其中男 19 例，女 21 例；年龄 14 ～ 40（25.8 ±10.57）岁，病程11～38（18±7.34）年。患者治疗前1周停抗组胺药及外用糖皮质激素、免疫调节剂；4周内未系统使用糖皮质激素、免疫抑制剂，未经过光疗或光化学治疗；既往无光敏感及眼部病变，无严重心、肺、肝、肾等疾病。健康对照组为健康志愿者30例，男 16例，女 14例，年龄 15～38（23.8±9.70）岁，个人及家族中均无遗传过敏史，两组受试者性别及年龄差异均无统计学意义。本实验经过医院伦理委员会批准。

二、主要试剂与仪器

人TSLP、IL-25 ELISA试剂盒为美国RD公司产品；总RNA提取液RNAisoTMPlus、逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Green 荧光定量PCR试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。NBUVB光疗仪为德国Waldmann公司产品。

三、方法

1.NB-UVB治疗：NB-UVB照射的初始剂量为最小红斑量的50%，即0.3～0.4 J/cm2，每周照射3次。照射时戴专用目镜，并保护外生殖器及非皮损区，照射距离约20 cm。如照射皮肤无红斑反应，以后每次剂量增加20%，至出现淡红斑维持该剂量，疗程12周，共照射36次，最大剂量2.5 J/cm2。若出现疼痛性红斑则暂停照射，在红斑消退后恢复照射，剂量减少50%，照射总次数不变。为防皮肤干燥，每次治疗后予以润肤乳外用。

2.疗效判断：采用欧洲的AD计分系统（scoring atopic dermatitis，SCORAD）［4］对严重程度进行评估，包括皮损范围、皮损严重程度、瘙痒和影响睡眠程度。皮损范围（A）：头颈部、臂各9%，躯干前、后各13.5%，下肢各22.5%；1%的面积为1分，最大评分100分；皮损严重程度（B）：采用0～3四级评分法，包括红斑、丘疹或水肿、渗出或结痂、表皮剥脱、苔藓化、皮肤干燥（评价未受累皮肤）共6项体征，根据皮损轻重程度分级，最大分值18分；瘙痒和影响睡眠程度（C）：按最近的3个昼夜平均计分，每项评分各为0～10分。计算公式为：总分=A/5+7B/2+C。采用视觉模拟标尺法（visual analogue scale，VAS）评价瘙痒程度（0为无瘙痒，10为剧烈瘙痒）。

记录治疗前后SCORAD积分和VAS积分。根据SCORAD积分计算积分下降指数：积分下降指数（%）=［（治疗前SCORAD积分-治疗后SCORAD积分）/治疗前SCORAD积分］×100%。痊愈：积分下降指数＞90%；显效：积分下降指数70%～90%；有效：积分下降指数30%～69%；无效：积分下降指数＜30%。总有效率=痊愈率+显效率+有效率。

3.实验方法：分别抽取患者治疗前后及健康对照者肘静脉血5 ml。EDTA抗凝，其中2 ml以2 500×g离心5min，取上清液，待ELISA检测；3ml应用Ficoll密度梯度离心法1 000×g离心20 min，取上中层界面处的白色云雾层狭窄带，待RT-PCR法检测。标本均置于-80℃冰箱保存备用。

（1）实时RT-PCR检测外周血单一核细胞（PBMC）中TSLP受体（TSLPR）mRNA、IL-25受体（IL-25R）mRNA的表达：①RNA提取：采用RNAisoTMPlus提取液严格按照说明书步骤提取。紫外分光光度仪测定RNA纯度，A260/A280比值控制在1.8～2.2之间；②反转录：参照试剂盒说明进行，反转录体系：PrimeScript缓冲液 2 μl，PrimeScript RT混合酶Ⅰ 0.5 μl，Oligo dT 引物 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，dT 引物 0.5 μl，总 RNA 500 ng，用 RNase Free dH2O 将体积调整为 10 μl，逆转录条件：37 ℃ 15 min，85℃5s；③SYBRGreen 实时定量 PCR：TSLPRmRNA引物：上游 5′-GCACACTGGCAATGTAATGC-3′，下游 5′-GTTGAACAGAACAAGTGACC-3′；IL-25R mRNA 引物：上游 5′-CCTTCCCGGACTGGTTCATT G-3′，下游 5′-AAGCCCCAGTCCCAGGTTTAC-3′；内参选取β肌动蛋白引物：上游5′-AGAGCCTCGC CTTTGCCGATCC-3′，下游 5′-CATGCCGGAGCCGT TGTCGAC-3′。实验步骤参照说明书进行；PCR反应体系：SYBR Premix Ex TapTM12.5 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物0.5 μl，模板2 μl。参照说明书设定PCR程序：95℃30 s预变性，然后95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s重复40个循环进行扩增。反应结束后，设定最佳阈值，获取每个标本的Ct值，根据仪器给出的标准曲线及斜率，获得目的基因的相对表达指数。

（2）ELISA法检测血清中TSLP、IL-25浓度：采用ELISA试剂盒，建立标准曲线，酶标仪测定450 nm处A值，根据标准曲线读取样品浓度。

4.统计学方法：采用SPSS19.0软件处理。各项数据均以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验，治疗前后采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床疗效

40例AD患者均完成治疗，其中痊愈3例，显效14例，有效13例，无效10例，总有效率75%。治疗后 SCORAD（20.36±5.12）和 VAS评分（3.05±1.02）均较治疗前（分别为55.26±10.88和8.20±1.37）明显下降，治疗前后比较，差异均有统计学意义（t值分别为10.29和8.16，均 P＜0.05）。

二、NB-UVB治疗前后AD患者血清TSLP、IL-25含量测定

治疗前AD患者组TSLP、IL-25含量明显高于健康对照组（表1），差异均有统计学意义（P＜0.05）；NB-UVB治疗后，均较治疗前明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗后与健康对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

三、NB-UVB治疗前后 AD患者 PBMC中TSLPR mRNA、IL-25R mRNA的检测

治疗前 AD患者组 TSLPR mRNA、IL-25R mRNA相对表达量均明显高于健康对照组（表1），差异均有统计学意义（P＜0.01）；NB-UVB治疗后，均较治疗前明显降低（P＜0.01）；治疗后与健康对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 窄谱中波紫外线治疗对特应性皮炎患者血清胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、白细胞介素25（IL-25）及其受体mRNA相对表达量的影响

讨 论

TSLP主要由上皮细胞分泌，能够促进B淋巴细胞生长、分化及T细胞增殖［5］，并对树突细胞（DC）的活化、分化、成熟和迁移起着重要的调控作用［6］，是启动过敏反应的重要因子。其受体TSLPR主要表达于DC、单核细胞和某些T细胞表面。研究证实［7］，TSLP在DC极化促进Th2细胞因子产生过程中发挥重要作用。上皮细胞经过敏原刺激后TSLP表达上调，TSLP能够活化CD11c+DC，被TSLP激活的DC（TSLP-DC）还可以启动CD4+T细胞前体向Th2转化，产生Th2生成倾向的微环境，分泌Th2型细胞因子，从而触发过敏性炎症反应。

IL-25是IL-17家族成员之一，主要由活化的Th2细胞和抗原刺激后的上皮细胞产生。研究显示［8-9］，腹腔注射 IL-25 至小鼠体内能诱导 IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子产生，介导Th2型免疫反应的发生。IL-25在Th2细胞介导的免疫反应的起始和维持阶段皆起重要作用。TSLP-DC刺激Th2记忆细胞表达IL-25R上调，而在IL-25存在的情况下，TSLP-DC活化的Th2记忆细胞分泌的Th2型细胞因子水平升高［10］。TSLP与IL-25共同刺激Th2记忆细胞增殖，在TSLP-DC驱动的Th2记忆细胞扩增期间通过上调转录因子GATA-3、C-MAF和JunB的基因表达，增强Th2细胞极化和细胞因子的产生，导致Th1/Th2细胞平衡失调。

本实验发现，AD患者 TSLP、IL-25及 TSLPR mRNA、IL-25R mRNA水平明显高于健康对照组，提示两者参与了疾病的发生。AD患者存在皮肤屏障功能障碍，与 IL-25 的活性有关［11］。Hvid 等［12］研究发现，IL-25能抑制角质形成细胞合成角质纤丝聚集蛋白，从而破坏皮肤屏障功能，促进炎症的发生。综上所述，我们认为上皮细胞经过敏原刺激后上调TSLP、IL-25表达，促进炎性细胞因子的分泌，促进Th2型免疫应答，同时Th2型细胞因子影响皮肤的屏障功能，使皮肤环境因子如过敏原、刺激物及微生物高度敏感，进一步加剧皮肤炎症反应。

中国AD诊断和治疗指南中指出，紫外线是治疗AD的有效方法且以NB-UVB的疗效最佳［13］。有资料显示［14］，NB-UVB 照射后 AD 患者 Th2、Th22 和Th1介导的免疫反应受抑制，使其异常分化和增殖趋于正常，表皮的屏障功能正常化。本实验研究发现，AD患者经过NB-UVB治疗后，临床疗效尚可，TSLP、IL-25及TSLPR mRNA、IL-25R mRNA水平较治疗前明显降低，治疗后与健康对照组相比较，差异无统计学意义。推测NB-UVB照射治疗通过降低TSLP、IL-25及其受体水平，使Th2细胞的分化、增殖及Th2型细胞因子的生成均受到抑制，有效减弱了Th2型免疫反应及表皮屏障功能障碍，从而减轻皮肤炎症反应，改善症状。NB-UVB照射后TSLP、IL-25及其受体水平降低的具体机制仍需进一步阐明。

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·学术动态·

外周血中的细菌DNA触发了银屑病的发生

银屑病作为一种系统性自身免疫性炎症性疾病，在免疫学方面与克罗恩病等炎症性疾病有相似之处。研究发现，细菌DNA片段能诱导克罗恩病的免疫反应。尽管大多数银屑病患者血细菌培养均为阴性，仍提出银屑病患者外周血中的细菌DNA片段触发了疾病的发生并诱导了炎症反应的假说。通过对外周血的检测发现，斑块状银屑病患者血液中细菌DNA阳性率较滴状、反向型银屑病和健康对照组明显升高；细菌DNA阳性患者外周血中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF和INF-γ表达水平较阴性患者和健康对照组明显升高；细菌DNA阳性患者发病年龄更早，病史更长。基因测序发现，大部分细菌DNA片段来源于大肠杆菌，其余的DNA片段也主要来源于肠道中的常见菌群。这些结果证实了银屑病患者肠道屏障通透性增加的假说，也证实细菌DNA的迁移在斑块状银屑病发病机制中起着重要作用。［JAMA Dermatol,2015,151（6）:670-671］（成都市第二人民医院皮肤科 张力文陈涛摘译）

Effects of narrow-band ultraviolet B on the expressions of thymic stromal lymphopoietin,interleukin-25 and their receptors in peripheral blood of patients with atopic dermatitis

Li Yujuan*,Jiang Yong,Li Huiqing,Wang Xiumin.*Department of Dermatology,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

ObjectiveTo explore the effects of narrow-band ultraviolet B （NB-UVB）on the serum levels of thymic stromal lymphopoietin （TSLP）and interleukin-25 （IL-25）,as well as on the expressions of TSLP receptor（TSLPR）and IL-25 receptor（IL-25R）mRNAs in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）from patients with atopic dermatitis（AD）.MethodsA total of 40 patients with AD and 30 healthy volunteers were enrolled in this study.All the patients were treated with NB-UVB at 0.3－2.5 J/cm2thrice a week for 12 consecutive weeks.Venous blood samples were obtained from these patients before and after the treatment as well as from these healthy controls.Doubleantibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect serum levels of TSLP and IL-25,and reverse transcription PCR（RT-PCR）to determine the mRNA expression levels of TSLPR and IL-25R in PBMCs from these subjects.The scoring atopic dermatitis（SCORAD）system developed by the European Task Force on Atopic Dermatitis was used to estimate the severity of AD,and visual analogue scale （VAS）to evaluate the degree of itch.Statistical analysis was carried out by the two-independent-samplet-test for intergroup comparisons and pairedt-test for comparisons between pre-and post-treatment samples from these patients.ResultsAfter the treatment with NB-UVB,the total response rate reached 75%（30/40）in these patients,with a significant decrease in SCORAD score from 55.26±10.88 before the treatment to 20.36±5.12 after the treatment（t=10.29,P＜0.05）and in VAS score from 8.20±1.37 to 3.05±1.02（t=8.16,P＜0.05）.Before the treatment,the patients showed a significant increase in the serum levels ofTSLP（198.24±29.47 ng/L vs.120.13±19.65 ng/L,t=29.70,P＜0.05）and IL-25（160.54±34.89 ng/L vs.120.41±43.07 ng/L,t=14.65,P＜0.05）,as well as in the mRNA expression levels of TSLPR （8.57±1.34 vs.1.94±0.39,t=7.07,P＜0.05）and IL-25R（6.81±0.50 vs.1.48±0.47,t=18.89,P＜0.05）compared with the healthy controls.With the improvement of conditions after the treatment,a significant decrease was observed in the serum levels of TSLP（151.87±14.78 ng/L,t=18.56,P＜0.05）and IL-25（130.52±29.65 ng/L,t=9.07,P＜0.05）,as well as in the mRNA expression levels of TSLPR （2.89±0.53,t=5.21,P＜0.05）and IL-25R （3.90±0.37,t=7.35,P＜0.05）in PBMCs from these patients compared with those before the treatment,and differences disappeared in all of these parameters between the patients and controls（allP＞0.05）.Conclusions TSLP and IL-25 may play important roles in the development of AD,and NB-UVB may treat AD by downregulating the expressions of them and their receptors.

Dermatitis,atopic;Ultraviolet rays;Thymic stromal lymphopoietin;Interleukin-25

Wang Xiumin,Email:wangxiumin@medmail.com.cn

作者单位：300211天津医科大学第二医院皮肤科（李玉娟、江勇）；山东省博兴县第二人民医院（李慧卿）；滨州医学院附属医院皮肤科（王秀敏）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.008

王秀敏，Email：wangxiumin@medmail.com.cn

2014-11-24）

（本文编辑：颜艳）