临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系

冯文莉 杨静 王一如 陈晋宇 乔祖莎 奚志琴 马彦

·论著·

临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系

冯文莉 杨静 王一如 陈晋宇 乔祖莎 奚志琴 马彦

目的 探讨临床分离白念珠菌ERG4基因高表达与唑类抗真菌药物耐药的关系。方法 M27-A2微量肉汤稀释法对34株临床分离白念珠菌菌株进行体外药物敏感性试验。抽提白念珠菌ERG4基因的总RNA，并逆转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）方法检测ERG4基因mRNA表达水平。结果 白念珠菌耐氟康唑菌株组ERG4基因表达量（4.20±2.56）高于敏感组（1.72±1.33）（t=3.99，P<0.05）；耐伊曲康唑组（3.60±2.47）高于敏感组（1.66±1.61）（t=3.71，P<0.05）；耐伏立康唑组（3.99±2.72）高于敏感组（2.07±1.58）（t=2.91，P<0.05）；对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同时耐药菌株组（4.49±2.73）显著高于敏感组（1.69±1.82）（t=3.81，P<0.05）。结论 临床分离白念珠菌耐药菌株ERG4基因高表达与氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐药及交叉耐药有关，但白念珠菌ERG4基因高表达在耐药中的作用还有待于通过基因下调进一步研究证实。

白色念珠菌；基因；抗药性，真菌；抗真菌药；基因表达；ERG4

近年来，随着广谱抗生素和糖皮质激素的大量应用，侵袭性治疗、器官移植以及免疫功能低下患者的增多，念珠菌感染逐年增加［1-2］，耐药现象日益严重［3］。有研究［4-5］认为，麦角甾醇合成途径中一些关键酶的编码基因如ERG11、ERG3、ERG5等的突变或过表达可导致麦角甾醇合成途径中相应编码的酶缺陷，在一定程度上改变白念珠菌对药物的敏感性，从而产生耐药。但白念珠菌麦角甾醇合成通路中其他靶酶基因如ERG4的高表达是否与耐药形成有关尚不清楚。本课题对临床分离白念珠菌菌株进行体外药物敏感性试验，获得耐药和敏感菌株，采用实时荧光定量PCR检测ERG4的mRNA表达水平，探讨ERG4基因高表达与白念珠菌耐唑类抗真菌药物的关系。

作者单位：030001太原，山西医科大学第二医院皮肤性病科（冯文莉、杨静、陈晋宇、乔祖莎、奚志琴、马彦）；太原市妇幼保健院皮肤科（王一如）

材料与方法

一、材料

1.实验菌株：来自2010年1月至2013年5月本科真菌实验室临床分离的白念珠菌34株，其中来自呼吸道分泌物19株、泌尿生殖道分泌物10株、血液1株、甲屑1株、皮肤鳞屑3株。标准菌株为白念珠菌ATCC11006，购自北京大学真菌与真菌病研究中心。

2.主要试剂与仪器：CHROMagar念珠菌显色培养基（郑州博赛生物技术股份有限公司）；API 20C AUX酵母菌鉴定系统（法国生物梅里埃公司）；氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑（天津力生制药股份有限公司）；UNIQ柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。Total RNA 提取试剂（TaKaRa RNAiso Reagent）、cDNA反转录试剂盒（TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix，RR036）、实时荧光定量（FQ-RT-PCR）反应试剂盒（TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTMII，RR820）均为宝生物工程（大连）有限公司产品。PCR引物、RT-PCR引物均委托上海英骏生物技术有限公司合成，双向测序由上海英骏生物技术有限公司完成。DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂），LG16-W高速离心机（北京京方公司），ATB1525Expression电子比浊仪（法国生物梅里埃公司），GelDocXR+凝胶成像系统（美国伯乐公司），Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白测定仪（德国艾本德股份公司），基因扩增仪Hema 4800（珠海黑马医学仪器有限公司），Qiagen Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪（德国Qiagen公司）。

二、方法

1.体外药物敏感性试验：参照美国国家临床和实验室标准化研究院（NCCLSI）推荐的M27-A2微量肉汤稀释法测定实验菌株的药物敏感性，按照表1的判定标准，筛选耐药菌株及敏感菌株。

2.ERG4基因表达水平定量测定：严格按照TaKaRa Yeast RNAiso Kit酵母Total RNA提取试剂盒说明书提取白念珠菌基因组RNA，-80℃保存备用。用核酸蛋白检测仪测量所提取的总RNA浓度，校正各菌株RNA浓度为500 mg/L。反转录得到模板cDNA，反应体系（10μl）：5×PrimeScriptRTMasterMix 2 μl，总 RNA 1 μl，DEPC 水 7 μl。扩增条件：37 ℃15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。

表1 美国国家临床和实验室标准化研究院推荐的念珠菌属药敏试验结果分界点（mg/L）

实时荧光定量PCR反应：①实时定量引物设计：在基因库中查找白念珠菌基因组，获取白念珠菌GAPDH、ERG4基因序列全长，采用primer 5.0软件设计GAPDH和qERG4引物。GAPDH（112 bp）：上游 5′-GTGCCAAAAAAGTTATGATC-3′，下游 5′-AGTTCTACCACCTCTCCAGT-3′；qERG4（1410 bp）：上游 5′-GTTTATTTTATTCTTCTTATCATTTGGA-3′，下游 5′-GGCACAATCAATTCTTCACCT-3′；②采用SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）试剂，分别以相同体积的cDNA扩增目的基因。反应体系（25 μl）：SYBR® Premix Ex TaqTMII（2 ×）12.5 μl，目的基因上、下游引物各 1 μl，cDNA 模板 2 μl，DEPC水 8.5 μl。扩增条件：95℃ 5 min预变性，95℃10 s，60℃30 s，重复此循环40次。65℃~95℃每5 s由PCR扩增仪自动读取1次熔解曲线，每个循环的荧光量由Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2系统软件自动监测并计算Ct值。ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH的Ct值，再通过与参照菌株ATCC11006相比获得ΔΔCt以2-ΔΔCt为目的基因的相对表达量，观察ERG4基因mRNA在实验菌株中的表达水平。每个菌株重复测量3次，取平均值。

3.统计方法：应用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据结果用±s表示，两组间ERG4基因mRNA表达量的比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、实验菌株药敏试验结果

34株白念珠菌临床分离株对氟胞嘧啶均敏感（100.00%）；33株对两性霉素B有较高的敏感性（97.06%），1株（2.94%，CA22菌株）耐药；对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑耐药菌株所占比例分别为52.94%（18/34）、70.59%（24/34）、50.00%（17/34），而对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑敏感的比例分别为47.06%（16/34）、29.41%（10/34）、41.18%（14/34），3 株菌（8.82%）对伏立康唑的敏感性为中介。1株（CA22来自龟头分泌物）对两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同时耐药，15株对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同时耐药，2株对氟康唑、伊曲康唑同时耐药，2株对伊曲康唑、伏立康唑同时耐药。标准菌株ATCC11006和其中的9株临床菌株对5种抗真菌药物均敏感。

二、实时荧光定量PCR扩增结果

1.耐氟康唑白念珠菌ERG4基因mRNA表达量：18株耐氟康唑菌株组ERG4基因mRNA表达量（4.20±2.56）高于16株敏感菌株组（1.72±1.33），两组比较，t=3.99，P<0.05。

2.耐伊曲康唑白念珠菌ERG4基因mRNA表达量：24株白念珠菌耐伊曲康唑菌株组ERG4基因mRNA表达量（3.60±2.47）高于10株敏感菌株组（1.66 ± 1.61），两组比较，t=3.71，P<0.05。

3.耐伏立康唑白念珠菌ERG4基因mRNA表达量：17株耐伏立康唑菌株组ERG4基因mRNA表达量（3.99±2.72）高于14株敏感菌株组（2.07±1.58），两组比较，t=2.91，P<0.05。

4.对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑交叉耐药的白念珠菌ERG4基因mRNA表达量：15株同时耐氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑菌株和9株同时敏感菌株分为交叉耐药组和敏感组，交叉耐药组ERG4基因mRNA表达量（4.49±2.73）高于敏感菌株组（1.69±1.82），两组比较，t=3.81，P<0.05。

讨 论

念珠菌ERG4基因编码甾醇C-24（28）还原酶（sterol C-24（28）reductase），是麦角甾醇生物合成途径中的最后一个酶，催化最终合成麦角甾醇［6］。有研究［7］表明，ERG4删除可导致麦角甾醇完全缺乏和其前体物质24（28）-脱氢麦角甾醇的积累，1株Erg4突变株表现出多效性的缺陷，如对二价阳离子和许多药物（如，放线菌酮、咪康唑、4-硝基喹啉、氟康唑和十二烷基硫酸钠）超敏反应。在酿酒酵母菌中，ERG4基因高表达可导致细胞中麦角甾醇含量提高［8-9］。由此推测，在对唑类药物耐药的白念珠菌中，为了补偿因唑类药物致使的麦角甾醇耗竭，白念珠菌负反馈上调ERG4基因的表达，生成大量麦角甾醇，使得真菌细胞内药物浓度不足以抑制14α-去甲基化酶，最终导致耐药［10-11］。是否通过此机制对耐药产生影响目前尚无研究证明。

在本研究中，白念珠菌耐氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑菌株组ERG4基因的表达量分别明显高于敏感菌株组，且对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑同时耐药菌株组ERG4基因的表达量也明显高于同时敏感菌株组，表明ERG4基因表达增高可能会导致白念珠菌产生耐药和交叉耐药现象。1株菌株（CA137）对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑同时耐药，ERG4基因mRNA表达量（2.06±0.20）较高。而1株菌株（CA133）对5种抗真菌药物均敏感，其ERG4基因mRNA表达量（0.01±0.00）很低。这一结果似乎也提示我们白念珠菌ERG4基因表达增高可能会导致产生耐药和交叉耐药现象。但尚需扩大样本量进一步证实。

值得一提的是，菌株CA22（来自龟头分泌物）对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和两性霉素B同时耐药，但其ERG4基因表达量（1.70±0.14）并不太高，提示白念珠菌对两性霉素B的耐药机制可能与ERG4基因的改变无明显相关性，或者ERG4基因高表达可能与多药耐药现象无关。但由于标本量过少，从上述结果尚不能轻易下结论，需进一步通过基因下调、人工耐药性诱导标准株、蛋白表达水平检测等方法来深入明确ERG4基因高表达与白念珠菌耐药之间的关系。

本研究中，有4株对5种抗真菌药物均敏感的白念珠菌菌株 CA11、CA44、CA91、CA24 的 ERG4 基因表达量分别为 2.49± 0.60、5.28±0.45、3.03±0.17、1.91±0.03，较标准菌株 ATCC11006（1.13±0.15）稍高，但还有6株敏感菌株的ERG4基因表达量并没有增高，说明白念珠菌耐唑类药物机制可能还存在某种调控因子如锌簇转录因子的调控作用［12］，尚待进一步研究。

［1］Yapar N.Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis［J］.Ther Clin Risk Manag,2014,10:95-105.

［2］张伟,林兆奋,赵瑾,等.重症监护病房真菌谱及耐药性6年变化趋势［J］.中国真菌学杂志,2014,9（1）:24-27,33.

［3］Basma R,Barada G,Ojaimi N,et al.Susceptibility ofCandida albicansto common and novel antifungal drugs,and relationship between the mating type locus and resistance,in Lebanese hospital isolates［J］.Mycoses,2009,52（2）:141-148.

［4］Espinel-Ingroff A,Pfaller MA,Bustamante B,et al.Multilaboratory study of epidemiological cutoff values for detection of resistance in eight Candida species to fluconazole, posaconazole, and voriconazole ［J］.Antimicrob Agents Chemother,2014,58（4）:2006-2012.

［5］Vale-Silva LA,Coste AT,Ischer F,et al.Azole resistance by loss of function of the sterol Δ5,6-desaturase gene （ERG3） inCandida albicansdoes not necessarily decrease virulence ［J］.Antimicrob Agents Chemother,2012,56（4）:1960-1968.

［6］Lai MH,Bard M,Pierson CA,et al.The identification of a gene family in theSaccharomyces cerevisiaeergosterol biosynthesis pathway［J］.Gene,1994,140（1）:41-49.

［7］Zweytick D,Hrastnik C,Kohlwein SD,et al.Biochemical characterization and subcellular localization of the sterol C-24（28）reductase,erg4p,from theyeast saccharomyces cerevisiae［J］.FEBS Lett,2000,470（1）:83-87.

［8］He X,Zhang B,Tan H.Overexpression of a sterol C-24（28）reductase increases ergosterolproduction in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnol Lett,2003,25（10）:773-778.

［9］He X,Guo X,Liu N,et al.Ergosterol production from molasses by genetically modifiedSaccharomyces cerevisiae［J］.Appl Microbiol Biotechnol,2007,75（1）:55-60.

［10］Henry KW,Cruz MC,Katiyar SK,et al.Antagonism of azole activity againstCandida albicansfollowing induction of multidrug resistance genes by selected antimicrobial agents ［J］.Antimicrob Agents Chemother,1999,43（8）:1968-1974.

［11］王一如,冯文莉.念珠菌ERG11基因耐药机制研究进展［J］.国际医药卫生导报,2013,19（9）:1226-1230.

［12］Schillig R,Morschhäuser J.Analysis of a fungus-specific transcription factor family,theCandida albicanszinc cluster proteins,by artificial activation［J］.Mol Microbiol,2013,89（5）:1003-1017.

2016年中华医学会-欧莱雅中国人健康皮肤/毛发研究项目评审结果

“2016年中华医学会-欧莱雅中国人健康皮肤研究项目”从2015年3月开始申报，共收到课题申请书38份，其中毛发7份，皮肤31份。中法评委通过函审和会审两个阶段的双盲评审，评选出14项资助课题，资助经费共计人民币90万元。2015年7月17日，在中华医学会第二十一次全国皮肤性病学术年会上举行了项目评审结果发布仪式，中华医学会邀请有关领导和专家为资助课题代表颁发了证书和中华医学会-欧莱雅杯。

获资助人员名单：慕彰磊（北京大学人民医院）；索丹凤（天津市第一中心医院）；纪超（福建医科大学附属第一医院）；曾跃平（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院）；姚燕（吉林大学）；刘琴（武汉大学中南医院）；李化国（上海交通大学医学院附属新华医院）；钟铧（西藏大学）；张宝旭（北京大学）；阳泰（成都医学院）；韩丽敏（北京大学）；赵玉磊（常州市第一人民医院）；李伟（浙江大学医学院附属第二医院）；程毅（河北医科大学第四医院）。

详情请关注中华医学会网站“科技评审”栏目之“中华医学会-欧莱雅项目”子栏目。

2016中国中西医结合皮肤性病学术年会征文通知

经中国中西医结合学会批准，中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会定于2016年4月21-25日在昆明市云安会都酒店召开中国中西医结合皮肤性病学术年会。此次会议将发扬历次年会的优良传统，注重中西医结合治疗皮肤病的新方法及新的研究进展等方面的学术交流，内容密切联系临床，切合皮肤科医师的实际需求。会议将邀请知名专家做特邀演讲，阐述皮肤科相关领域的最新研究进展，创造形式多样、内容充实、紧张热烈、活跃互动的学术交流形式，达到全国皮肤科中医、西医、中西医结合医师共同展现才华、获取知识和信息、增进友谊的目的。欲参加者请仔细阅读本通知，并在规定时间内按要求投稿。

一、投稿要求：①投稿内容：皮肤科基础研究论文、皮肤科临床诊断和治疗等方面的论文、典型与疑难病例等；②投稿方式：中文全文和400字以内的中文摘要，请通过电子邮件投稿，Email：pfkxh@126.com。来稿请注明2016会议征文，截稿日期：2016年3月3日；③会议交流形式：特邀讲演、大会发言、分会发言、书面交流。

二、联系方式：上海市黄浦区成都北路500号峻岭广场19楼1908室，上海长征医院《中国真菌学杂志》编辑部，邮编200003，Email：pfkxh@126.com，联系人：施慧，021-81885497，手机 13764560811。

第五届国际大疱病学术研讨会通知

2015年10月24-25日在上海交通大学医学院附属瑞金医院召开“第五届国际大疱病学术研讨会”。届时，美国宾夕法尼亚大学John Stanley、爱荷华大学Janet Fairley、北卡罗来纳大学Zhi Liu、日本庆音大学Masayuki Amagai、德国吕贝克大学Detlef Zillinkens和法国鲁昂大学医院Pascal Joly等著名教授和国内专家将做专题报道。此次会议还安排1天中国学者的发言，应国外同行请求，PPT以双语展示，用中文发言。这是一次纯学术、显示国际大疱病最高研究水平的会议，欢迎参加。会议不收注册费，交通住宿费自理。拟发言交流者请于2015年6月30日前将姓名、单位、联系方式、发言题目和摘要发给联系人；参加者请于2015年8月31日前将姓名、单位、联系方式发给联系人。联系人：袁勇勇，Email：yyyluofan@163.com。

Relationship between ERG4 gene overexpression and azole resistance in clinicalCandida albicansstrains

Feng Wenli*,Yang Jing,Wang Yiru,Chen Jinyu,Qiao Zusha,Xi Zhiqin,Ma Yan.*Department of Dermatology and Venereology,Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

ObjectiveTo explore the relationship between ERG4 gene overexpression and azole resistance in clinicalCandida albicansstrains.MethodsThe National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）M27-A2 broth microdilution method was conducted to evaluate antifungal susceptibility of 34 clinicalCandida albicansisolates in vitro.Total RNA was extracted from theseCandida albicansstrains and transcribed into cDNA.Real-time fluorescencebased quantitative PCR was performed to determine the mRNA expression of ERG4 gene.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test.ResultsThe expression level of ERG4 mRNA was significantly higher in fluconazoleresistant than in-sensitiveCandida albicansstrains（4.20±2.56 vs.1.72±1.33,t=3.99,P<0.05）,higher in itraconazole-resistant than in-sensitiveCandida albicansstrains（3.60±2.47 vs.1.66±1.61,t=3.71,P<0.05）,and higher in voriconazole-resistant than in-sensitiveCandida albicansstrains（3.99±2.72 vs.2.07±1.58,t=2.91,P<0.05）.Further more,increased ERG4 mRNA expression was also observed in isolates cross-resistant to all the three azole antifungal agents compared with those susceptible to all of them （4.49±2.73 vs.1.69±1.82,t=3.81,P<0.05）.ConclusionsThe overexpression of ERG4 gene may be associated with cross resistance to fluconazole,itraconazole and voriconazole in clinicalCandida albicansstrains,but its exact role is expected to be investigated through downregulation of the ERG4 gene.

Candida albicans;Genes;Drug resistance,fungal;Antifungal agents;Gene expression;ERG4

Feng Wenli,Email:fwl92@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.003

山西省基础研究项目（2012011045-3）；山西省青年科技研究基金（2012021035-3）；山西省卫生和计划生育委员会科研课题计划（2014044）；山西医科大学科技创新基金（01201013）

冯文莉，Email：fwl92@hotmail.com

2014-10-30）

（本文编辑：吴晓初）