茶多酚、吡美莫司、他克莫司外用对莫诺苯宗诱导白癜风样模型小鼠的疗效比较

李情 祝逸平 许爱娥

茶多酚、吡美莫司、他克莫司外用对莫诺苯宗诱导白癜风样模型小鼠的疗效比较

李情 祝逸平 许爱娥

目的 探讨茶多酚、吡美莫司、他克莫司对莫诺苯宗诱导的白癜风样模型小鼠的疗效差异。方法 45%莫诺苯宗诱导C57BL/6三周龄雌小鼠脱色，建立白癜风样动物模型。并研究他克莫司、吡美莫司、茶多酚对白癜风样模型小鼠脱色的治疗效果。通过肉眼观察毛发脱色及脱色面积，实验结束后取非用药部位脱色皮肤行组织学检查，HE染色检测淋巴细胞浸润情况，共聚焦激光扫描显微镜（RCM）观察小鼠皮肤的黑素和黑素细胞，免疫荧光检测CD8+T细胞。结果 模型组小鼠在用药部位及非用药部位均有脱色现象。他克莫司组、吡美莫司组、茶多酚组小鼠脱色减少，出现时间晚和面积指数均较模型组低；且用药部位脱色斑局部淋巴细胞和CD8+T细胞浸润减少。其中他克莫司组疗效优于其他组。结论 他克莫司、吡美莫司、茶多酚对白癜风样模型小鼠均有疗效。

莫诺苯宗；茶多酚；他克莫司；吡美莫司；白癜风，动物模型

目前，钙调磷酸酶抑制剂他克莫司和吡美莫司已在临床广泛应用，对特应性皮炎（AD）、白癜风均有疗效。针对白癜风的氧化应激发病学说，可开发抗氧化剂治疗白癜风，其中茶多酚是一种天然的抗氧化剂，有抗菌、清除自由基作用。本实验用他克莫司、吡美莫司作为阳性对照，比较他克莫司、吡美莫司、茶多酚对莫诺苯宗诱导的白癜风样模型小鼠的治疗作用，以便临床筛选药物。

资料与方法

一、材料

1.动物来源：C57BL/6小鼠，雌性，质量（14 ± 2）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司（合格证号SCXK沪2007-0005），在常规实验室条件下，饲养于浙江中医药大学动物实验室。

2.主要试剂和仪器：莫诺苯宗（美国Sigma公司）由本院制剂室制备成45%乳膏，0.03%他克莫司购于安斯泰来制药（中国）有限公司，1%吡美莫司乳膏购于诺华制药（中国）有限公司，10%茶多酚购于美国Sigma公司，由本院制剂室制备成10%软膏。皮肤共聚焦激光扫描显微镜（RCM）Vivascope1500购于美国Lucid公司，波长830 nm，最大输出16.0 mW，免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）Fluo View FV1000型购于日本Olympus公司，波长488 nm。

二、方法

1.建立白癜风样模型并分组［1-2］：C57BL/6 小鼠25只，依次编号后用随机数字表分组，25只小鼠随机分为阴性对照组、模型组、茶多酚组、吡美莫司组和他克莫司组共5个组，每组5只，脱去小鼠背部2 cm×2 cm区域黑色毛，用刮勺稍用力涂药直至吸收。阴性对照组：每天涂抹凡士林50 mg 1次；模型组：每天涂抹45%莫诺苯宗50 mg 1次；茶多酚组：每天涂抹茶多酚50 mg 1次和45%莫诺苯宗50 mg 1次；吡美莫司组：每天涂抹吡美莫司50 mg 2次和45%莫诺苯宗50 mg 1次；他克莫司组：每天涂抹他克莫司50 mg 2次和45%莫诺苯宗50 mg 1次。各组小鼠连续用药40 d，停药后连续15 d肉眼观察小鼠毛发颜色和脱色面积变化，通过RCM观察皮肤黑素颗粒。

2.毛发脱色评估［3］：每日肉眼观察毛发脱色情况，并记录积分。将脱色部位分为用药部位和非用药部位，每个部位总分为5分，每只小鼠共10分。小鼠毛发脱色评分标准：0分为毛发无脱色；1分为毛发脱色面积0～10%；2分为毛发脱色面积11%～25%；3分为毛发脱色面积26%～50%；4分为毛发脱色面积26%～75%：5分为毛发脱色面积76%～100%。

3.组织病理：模型组在背部白斑处取皮，对照组在正常处取皮，筋膜以上组织必须新鲜，即处死后立刻进行。脱毛后，镊子夹起，剪下组织，放入福尔马林中按常规制备切片，行HE染色。

4.免疫荧光：检测CD8+T细胞的荧光定量表达，采用单一绿色荧光通道观察，在488 nm波长以上扫描观察。观察并由计算机自带扫描分析软件测定，每张切片选取荧光表达最强的5个视野（×200）中单位面积CD8+T细胞的荧光强度。

5.皮肤CT：应用RCM实时观察建模前后小鼠正常区和脱色区皮肤处在同一层面的皮肤内黑素细胞。

6.统计学分析：应用SPSS软件17.0进行分析，测定结果以±s表示，两组间定量资料采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、各组小鼠脱色时间比较

模型组：用药部位在实验第14天开始出现点状脱色，第16天全部小鼠的用药部位出现脱色且脱色斑逐渐扩大，第21～23天形成斑片状，用药40 d时，皮损扩大并部分融合；躯干的非用药部位在实验第23天出现脱色斑，第40天有3只小鼠在躯干部位有脱色斑（图1箭头）。停药后连续15 d观察小鼠毛发脱色部位的颜色和面积变化。结果显示，4只小鼠脱色斑稳定，仅1只小鼠有少量复色，2只小鼠非用药部位的脱色斑扩大。阴性对照组：涂抹凡士林40 d，未出现脱色斑（图2）。茶多酚组、吡美莫司组和他克莫司组脱色的发生率较模型组降低，开始脱色时间推迟，非用药部位出现脱色斑的时间和平均时间均延迟。见表1。

图1 模型组小鼠用药部位脱色斑（箭头），躯干可见大量脱色斑块

图2 阴性对照组小鼠未见脱色斑（箭头）

二、组织病理

HE染色显示，模型组脱色斑及其周围皮肤的真皮浅层有淋巴细胞浸润（图3A），阴性对照组仅有少量淋巴细胞浸润（图3B）；免疫荧光显示模型组脱色斑及其周围皮肤的CD8+T细胞浸润（图4A），阴性对照组（4B）极少量CD8+T细胞浸润；皮肤CT显示模型组小鼠非用药部位的脱色斑可见色素缺失（图5A），折光弱；阴性对照小鼠正常皮肤色素正常，分布均匀，折光强（5B）。

图3 模型组（3A）显示真皮浅层淋巴细胞多量浸润图；阴性对照组（3B）真皮浅层淋巴细胞浸润少（HE×400）

图4 CD8+T细胞浸润的情况 模型组小鼠（4A）在真皮浅层CD8+T细胞浸润（箭头）；阴性对照组小鼠（4B）在真皮浅层几乎无CD8+T细胞浸润（箭头）

图5 共聚焦激光扫描显微镜观察小鼠黑素及黑素细胞 模型组小鼠（5A）非用药部位的脱色斑可见色素缺失，折光弱；阴性对照小鼠（5B）正常皮肤色素正常，且分布均匀，折光强

表1 各组小鼠脱色时间比较（d）

三、脱色面积指数、稳定性和CD8+T细胞表达

茶多酚组、吡美莫司组和他克莫司组小鼠的脱色面积均较模型组小（P<0.05），在非用药部位脱色面积差异更明显（P<0.05）。停药后15 d内模型组中有1只小鼠出现少量复色，他克莫司组3只小鼠有不同程度复色，吡美莫司组有2只，茶多酚组也有2只小鼠出现复色迹象，他克莫司、吡美莫司、茶多酚这3组小鼠均未出现扩大现象。模型组表达CD8+T细胞明显，茶多酚、吡美莫司组在绿色背景中可见少量高亮CD8+T细胞；茶多酚组、吡美莫司组和他克莫司组CD8+T细胞表达量与模型组比均较低（P<0.05），差异有统计学意义。吡美莫司、茶多酚组CD8+T细胞表达量相比P<0.05，差异有统计学意义。茶多酚、模型组CD8+T细胞表达量相比P<0.05，差异有统计学意义。见表2。

表2 各组小鼠脱色面积指数CD8+T细胞表达量差异（±s）

表2 各组小鼠脱色面积指数CD8+T细胞表达量差异（±s）

注：n=5。a：以上3个组用药部位、非用药部位脱色面积、CD8+T细胞表达与模型组比较，P<0.05

组别 用药部位 非用药部位 CD8+T细胞表达量茶多酚组 2.11±0.35 1.03±0.46 178.486±9.373吡美莫司组 2.37±0.39 1.45±0.29 168.237±9.891他克莫司组 2.49±0.58 1.58±0.28 97.469±8.365模型组 3.37±0.16a 1.73±0.33a 287.545±9.034a阴性对照组 - - 59.934±3.236

讨 论

CD8+T细胞可能是白癜风自身免疫的主要效应细胞，CD8+T介导细胞间免疫反应，通过释放颗粒酶特异杀伤黑素细胞［4］。莫诺苯宗对酪氨酸酶的泛素化作用可以直接诱导CD8+T的反应，从而杀灭黑素细胞，引起皮肤脱色［5］。模型组小鼠局部皮损处CD8+T浸润增加，可能由于莫诺苯宗通过黑素小体自噬作用和酪氨酸酶的泛素化作用，提呈黑素小体相关抗原并在表面产生MHCⅠ和Ⅱ分子，直接诱导CD8+T和CD4+T反应［6］。模型组血清中IL-6和TNF-α的含量明显高于正常组，这与人白癜风的自身免疫反应符合［7-8］。

茶多酚可以通过抗氧化作用治疗白癜风［9］。它可以对抗CD8+T杀伤黑素细胞［6］，其机制可能是通过降低TNF-α的分泌治疗白癜风［10］。非节段型白癜风发病的主要机制可能为CD8+T细胞对黑素细胞的杀伤作用［11］。茶多酚有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯可以上调水通道蛋白3A的表达，增强皮肤屏障功能［12］。

本实验通过观察10%茶多酚软膏对莫诺苯宗诱导小鼠脱色的影响，以吡美莫司和他克莫司组作为阳性对照，结果显示茶多酚、吡美莫司和他克莫司组均有治疗效果，他克莫司组疗效更明显，主要表现在开始出现脱色斑时间迟，面积小，非用药部位脱色斑的发生率降低及复色现象明显。茶多酚组亦有疗效，脱色斑出现时间、脱色指数均较模型组低，真皮浅层淋巴细胞浸润较模型组少。停药后15 d内，茶多酚组有2只小鼠出现复色迹象，吡美莫司组2只小鼠有复色迹象，他克莫司3只小鼠出现不同程度复色，这3组小鼠均没有出现扩大现象。茶多酚组、吡美莫司组和他克莫司组脱色的发生比例和开始脱色时间较模型组明显推迟，非用药部位出现脱色斑的时间和平均时间也延迟。

白癜风患者复色区可见树突状，高折光性的黑素细胞［13］，这与各治疗组复色部位皮肤表现一致。茶多酚组血清中和肿瘤坏死因子α的含量低于模型组，原因可能为，氧自由基导致的黑素细胞破坏或功能障碍，T细胞免疫和氧化应激在白癜风发病中相互影响［14］。茶多酚具有抗炎的作用，抑制肿瘤坏死因子α、干扰素γ、巨噬细胞增殖从而抗氧化、抑制脱色。他克莫司组局部CD8+T细胞浸润明显减少，可能是由于抑制各种T细胞炎症因子的表达，从而减少黑素细胞损伤，促进复色。吡美莫司组局部组织CD8+T细胞浸润减少与抑制的钙调神经磷酸酶阻止胞质内和T细胞激活有关的核网子的去磷酸化有关，因此吡美莫司抑制早期T细胞激活基因IL-2的基因转录，从而抑制细胞毒型T细胞的生长和增殖。本研究以他克莫司、吡美莫司作为阳性对照，结果表明茶多酚治疗白癜风有效。我国茶资源丰富，茶多酚安全且毒性极地，具有开发利用价值。茶多酚治疗白癜风的机制还需动物实验和临床研究进一步验证。

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Comparison of topical application of tea polyphenol versus pimecrolimus versus tacrolimus for the treatment of monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in a mouse model

Li Qing,Zhu Yiping,Xu Ai′e.Department of Dermatology,Third People′s Hospital of Hangzhou,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China

Xu Ai′e,Email:xuaiehz@msn.com

Objective To compare the therapeutic effect of topical application of tea polyphenol versus pimecrolimus versus tacrolimus for monobenzone-induced vitiligo-like depigmentation in mice.Methods Twentyfive 3-week-old female C57BL/6 mice were randomly and equally divided into 5 groups:negative control group,model group,tea polyphenol group,pimecrolimus group,tacrolimus group.Monobenzone 45%cream was applied to the back of mice in all the five groups except the negative control group once daily for 40 consecutive days to establish a model of vitiligo-like depigmentation.During the induction of depigmentation,the tea polyphenol group,pimecrolimus group and tacrolimus group were topically treated with tea polyphenol,pimecrolimus and tacrolimus respectively,and the model group remaining untreated.The depigmentation of hairs and skin was observed by naked eyes on a daily basis.Tissue specimens were obtained for histological examination from depigmented skin at nonapplication sites in mice after the end of the experiment.Hematoxylin-eosin staining was conducted to analyze lymphocytic infiltration,reflectance confocal microscopy to observe melanin and melanocytes in skin,and immunofluorescence assay to detect CD8+T cell infiltration.Results Depigmentation occurred in both application sites and non-application sites of mice in the model group.Compared with the model group,the tacrolimus,pimecrolimus and tea polyphenol groups showed delayed depigmentation,reduced degree and area index of depigmentation,and attenuated lymphocytic infiltration and CD8+T cell infiltration in depigmented maculae at application sites.In addition,the therapeutic effect of tacrolimus was stronger than that of pimecrolimus and tea polyphenol.Conclusion Tea polyphenol,pimecrolimus and tacrolimus are all effective for the treatment of vitiligolike depigmentation in mice.

Monobenzone;Tea polyphenol;Tacrolimus;Pimecrolimus;Vitiligo,animal model

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.014

杭州市重大科技创新项目（20122513A02）

310053杭州，浙江中医药大学附属杭州市第三人民医院皮肤科

许爱娥，Email：xuaiehz@msn.com

2014-04-07）

（本文编辑：吴晓初）