系统性红斑狼疮患儿Epstein-Barr病毒基因异常表达的研究

丁艳 何小解 廖旺 杨慧兰 向伟 党西强 易著文

系统性红斑狼疮患儿Epstein-Barr病毒基因异常表达的研究

丁艳 何小解 廖旺 杨慧兰 向伟 党西强 易著文

目的 探讨Epstein-Barr病毒（EBV）基因在儿童系统性红斑狼疮（SLE）中的表达和意义。方法分离20例SLE患儿和12例健康对照外周血单一核细胞（PBMC），用酶联免疫吸附测定（ELISA）鉴定出血清中编码EBV衣壳抗原-IgG/IgM抗体阳性的SLE患儿，取其分泌EBV的细胞上清液与提取的PBMC共同培养12 d，提取培养前后的PBMC的RNA，用反转录实时定量PCR（RT-PCR）的方法检测EBV基因的表达。结果10例患儿和1例健康对照检测到LMP1表达，两者差异有统计学意义（P<0.05）。4例患儿和1例健康对照检测到LMP2表达，13例患儿和3例健康对照检测到EBNA1表达，3例患儿和1例健康对照检测到BCRF1表达，5例患儿和2例健康对照检测到BLLF1表达，但患儿和健康对照比较，差异均无统计学意义。用分泌EB病毒的细胞上清液培养PBMC后，发现患儿组和健康对照组潜伏期基因和裂解期基因表达均有不同程度的增加，潜伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1和裂解期基因BCRF1、BLLF1的表达与健康对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 儿童SLE患者存在EBV基因的异常表达，EBV基因可能参与了SLE的发病。

红斑狼疮，系统性；EB病毒感染；基因表达；儿童

对象和方法

一、对象

2012年1月至2013年11月，海南省妇幼保健院皮肤科与中南大学湘雅二医院儿童医学中心小儿肾脏专科收治SLE患儿20例，男8例，女12例，年龄3～14岁，平均（8.2±2.9）岁。海南省妇幼保健院儿童保健科体检健康儿童12例，男5例，女7例，年龄4～13岁，平均（8.7±2.4）岁，家族中无自身免疫性疾病史。SLE的诊断依据1982年美国风湿病协会修正的诊断标准［4］。经方差分析和χ2检验，各组之间年龄和性别分布差异均无统计学意义。本文研究通过海南省妇幼保健院伦理会的批准，每例患儿家长均签署了知情同意书。

二、方法

1.细胞分离：抽取SLE患儿及健康对照组肝素抗凝静脉血10 ml。用淋巴细胞分离液常规分离PBMC。

2．细胞培养：用酶联免疫吸附测定（ELISA）鉴定出血清中编码EBV衣壳抗原（VCA）-IgG/IgM抗体阳性的患儿，取其分泌EBV的细胞上清液与提取的PBMC共同培养12 d。

3.RNA提取：用Trizol誖试剂（美国Invitrogen公司），依据说明书操作分别提取培养前及培养后SLE患儿组及健康对照组PBMC RNA。

4.实时定量RT-PCR法检测EBV基因的表达：cDNA的合成用反转录试剂盒（美国Fermentans公司），反应体系：18 μl（1～5 μg）RNA，5 × 反应缓冲液 5 μl，2.5 U/μl Poly A 聚合酶 1 μl，RT 混合1 μl，总体积 25 μl混匀，短暂离心，37 ℃反应 1 h，然后85℃5 min使反转录酶失活，取出置－20℃冰箱保存。

实时PCR：在Icycler IQ实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）进行PCR技术检测EBV基因EBV 核抗原 1（EBNA1），潜伏膜蛋白 1（LMP1），潜伏膜蛋白 2（LMP2），即刻裂解基因（BZLF1），晚期裂解基因（BcRF1），晚期裂解基因（BLLF1）。引物序列由上海博亚生物技术有限公司合成：EBNA1：上游引物 5′-TGCCCCCTCGTCAGACATGATT-3′和下游引物 5′-AGCGTGCGCTACCGGAT-3′；LMP1:上游引物 5′-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3′和下游引物5′-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAA GT-3′；LMP2：上游引物 5′-ATGACTCATCTCAACA CATA-3′和下游引物 5′-CATGTTAGGCAAATTGCA AA-3′；BZLF1：上游引物 5′-CGCCTGGGCATTCGTG TTAGTATAT-3′和下游引物 5′-AAGAATCGGGTGG CTTCCAGAA-3′；BcRF1：上游引物 5′-AGGGCCTGT TTGATTTCTCCAAGAG-3′和下游引物5′-TTTGTCA CGTTCGCCGAATGTC-3′；BLLF1：上游引物 5′-CAT TGGTAGCCGTTCGTGTGATAAT-3′和下游引物 5′-GCGAGCAATCGGACATTTGACAT-3′。PCR 反应体积为20 μl，反应体系为2×SYBR Green qPCR混合 10 μl，（10 μmol/L）上下游引物各 1 μl，cDNA 1 μl，水 7 μl。PCR 反应条件为：95 ℃预变性，3 min，之后每一步95℃变性，10 s，58℃退火延伸30 s，共进行35个循环，每次在延伸阶段读取荧光值。采用标准曲线相对定量法进行结果分析。

5.统计方法：本研究用SPSS13.0统计软件分析。计数资料比较采用χ2检验或使用Fisher精确概率法；两组间比较用t检验。。

结 果

一、儿童SLE血液中异常潜伏和裂解基因表达

用RT-PCR检测了SLE患儿及健康对照PBMC EBV基因表达，发现10例患儿和1例健康对照检测到潜伏期基因LMP1表达，两者有统计学意义差异（P<0.05）。4例患儿和1例对照检测到潜伏期基因LMP2表达，13例患儿和3例对照检测到潜伏期基因EBNA1表达，3例患儿和1例对照检测到裂解期基因BCRF1表达，5例患儿和1例对照检测到裂解期基因BLLF1表达，但差异均无统计学意义。结果见表1。

表1 SLE患儿组及健康对照组PBMC EBV基因的阳性表达

二、培养后儿童SLE血液中异常潜伏和裂解基因的表达

用分泌EBV的细胞上清液培养SLE患儿和健康对照PBMC后，RT-PCR检测EBV基因表达，结果发现患儿组和健康对照组潜伏期基因和裂解期基因表达均有不同程度的增加，潜伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1 和裂解期基因 BCRF1、BLLF1 的表达与健康对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

表2 培养后SLE患儿组及健康对照组PBMC EBV基因的表达（±s）

表2 培养后SLE患儿组及健康对照组PBMC EBV基因的表达（±s）

注：P值为SLE患儿组与健康对照组比较

组别 例数SLE患儿组 20健康对照组 12 t值P值LMP1 LMP2 EBNA1 BZLF1 BCRF1 BLLF1 1.011±0.141 1.001±0.093 1.012±0.163 0.889±0.191 1.015±0.167 1.038±0.264 0.383±0.171 0.208±0.082 0.188±0.129 0.713±0.278 0.344±0.161 0.117±0.081 10.680 25.109 14.591 1.935 11.268 14.513 0.000 0.000 0.000 0.069 0.000 0.000

讨 论

在健康人血液中，EBV感染的细胞保持较低的频率，但稳定较长时间。而在SLE患者中，EBV受SLE免疫功能障碍影响，它可能导致血液中不合适的病毒基因的表达［5］。本实验用RT-PCR方法分别检测了SLE患儿组和健康对照组PBMC中EBV基因表达，发现SLE患儿组和健康对照组均有EBV潜伏期基因LMP1、LMP2、EBNA-1的表达和裂解期基因BCRF1、BLLF1的表达，但SLE患儿组潜伏基因和裂解期基因表达的阳性率均高于健康对照组，其中SLE患儿组潜伏期基因LMP1的表达显著高于健康对照（P<0.05），与国外对于成人SLE中EBV的研究一致［5］，提示LMP1可能在儿童SLE的发病中起到一定的致病作用。本研究结果表明，SLE患儿及部分健康对照均有EBV基因的表达，但SLE患儿本身存在异常的B细胞亚群、活化标记物的表达以及细胞内信号的紊乱等免疫功能障碍，导致EBV基因的异常表达，可能是儿童SLE致病的原因之一。为进一步验证实验结果，本研究用分泌EBV的细胞上清液培养SLE患儿组和健康对照组PBMC共12 d，用RT-PCR方法检测6种不同基因的表达，结果发现培养后潜伏期基因和裂解期基因表达均有不同程度的增加，其中除BZLF1外，潜伏期基因 LMP1、LMP2、EBNA-1 和裂解期基因 BCRF1、BLLF1的表达与健康对照组比较，差异有统计学意义（均P<0.05），提示它们可能参与了儿童SLE发病的过程。

LMP1和LMP2提供替代B细胞的存活和分化的信号（分别为CD40和BCR）［3］。国外的研究表明，LMP-1能够通过多种机制加重SLE的自身反应性，包括直接激活B细胞，增强B细胞活化的协同刺激信号［6-7］，刺激 B细胞活化因子（BAFF）的产生，能够协助打破自我耐受等［8］。本研究中，20例SLE患儿中有10例LMP1阳性，培养后患者的LMP1表达显著增加，提示LMP1在儿童SLE的发病中可能起着重要作用。

EBNA-1基因编码的EBNA-l是病毒复制所需的唯一的病毒编码蛋白，能被病毒特异性CTL识别，引起免疫应答［1］。EBNA-l与Sm B自身免疫抗体靶向的开始序列有很大的同源性［9］，通过分子模拟机制，打破自身免疫耐受，产生大量抗Sm B抗体。此外，EBNA-1的部分序列与Ro开始序列也存在交叉反应，产生抗Ro抗体［9］。裂解期基因BCRF1主要编码VIL-10，VIL-10与人IL-10有83%的同源性，具有与人IL-10类似调节B淋巴细胞增殖和分化的功能［10］。晚期裂解基因BLLF1，其编码产物gp350/220作为膜抗原结合B细胞上表达CD21分子，进人细胞内,感染B淋巴细胞［11］。本研究发现，SLE患儿组中BCRF1与BLLF1表达较健康对照组增加，且用分泌EBV的细胞上清液培养后SLE患儿组较健康对照组表达有显著增加，与国外Cross对于成人SLE的研究一致［5］，提示SLE患儿中亦可能存在更多的裂解期EBV感染。BZLF1是EBV的早期即刻基因，是病毒从潜伏状态活化进入裂解期后最早表达的基因。本研究SLE患儿及培养后的PBMC的BZLF1表达均为阴性，与陈官芝等［12］研究结果相似，提示EBV增殖复制的激活可能通过其他途径。

［1］丁艳,肖嵘,张燕,等.系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞CD70基因表达及其启动子区域甲基化状态的研究［J］.中华皮肤科杂志,2013,46（2）:80-83.

［2］Draborg AH,Duus K,Houen G.Epstein-Barr virus and systemic lupus erythematosus［J］.Clin Dev Immunol,2012,2012:370516.

［3］Larsen M,Sauce D,Deback C,et al.Exhausted cytotoxic control of Epstein-Barr virus in human lupus［J］.PLoS Pathog,2011,7（10）:e1002328.

［4］Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum,1982,25（11）:1271-1277.

［5］Gross AJ,Hochberg D,Rand WM,et al.EBV and systemic lupus erythematosus:a new perspective［J］.J Immunol,2005,174（11）:6599-6607.

［6］Niller HH,Wolf H,Minarovits J.Regulation and dysregulation of Epstein-Barr virus latency:implications for the development of autoimmune diseases［J］.Autoimmunity,2008,41（4）:298-328.

［7］Peters AL,Stunz LL,Meyerholz DK,et al.Latent membrane protein 1,the EBV-encoded oncogenic mimic of CD40,accelerates autoimmunity in B6.Sle1 mice ［J］.J Immunol,2010,185（7）:4053-4062.

［8］Yurasov S,Wardemann H,Hammersen J,et al.Defective B cell tolerance checkpoints in systemic lupus erythematosus［J］.J Exp Med,2005,201（5）:703-711.

［9］Pratesi F,Tommasi C,Anzilotti C,et al.Deiminated Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 is a target of anti-citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum,2006,54（3）:733-741.

［10］Lucas A,McFadden G.Secreted immunomodulatory viral proteins as novel biotherapeutics［J］.J Immunol,2004,173（8）:4765-4774.

［11］Urquiza M,Lopez R,Pati觡o H,et al.Identification of three gp350/220 regions involved in Epstein-Barr virus invasion of host cells［J］.J Biol Chem,2005,280（42）:35598-35605.

［12］陈官芝,张炜,李惠,等.系统性红斑狼疮患者中Epstein-Barr病毒增殖期基因的表达［J］.中华皮肤科杂志,2006,39（1）:13-15.

Aberrant expression of Epstein-Barr virus genes in children with systemic lupus erythematosus

Ding Yan*,He Xiaojie,Liao Wang,Yang Huilan,Xiang Wei,Dang Xiqiang,Yi Zhuwen.*Graduate School of Southern Medical University,Guangzhou 510015,China

s:Yang Huilan,Email:huilany88@hotmail.com;Xiang Wei,Email:xiangwei@163.com

Objective To investigate the expression and significance of Epstein-Barr virus（EBV）genes in children with systemic lupus erythematosus （SLE）.Methods Peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）were isolated from 20 children with SLE and 12 healthy human controls.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect anti-EBV viral capsid antigen（VCA）IgG/IgM antibodies.The culture supernatants of cells from patients with anti-EBV VCA IgG/IgM antibodies were collected,and PBMCs from the patients and controls were co-cultured with the supernatants respectively for 12 days.RNA was extracted from PBMCs before and after the coculture,and reverse transcription-PCR was performed to detect the expression of EBV genes,including LMP1,LMP2,EBNA1,BCRF1,BLLF1 and BILF1 genes.Results LMP1 gene was detected in fresh PBMCs from 10 out of 20 patients and 1 out of 12 controls （P<0.05）.No significant differences were observed between the patients and controls in the detection rate of LMP2 gene（4/20 vs.1/12）,EBNA1 gene（13/20 vs.3/12）,BCRF1 gene（3/20 vs.1/12）or BLLF1 gene （5/20 vs.2/12）in fresh PBMCs.After co-culture with the supernatants of cells from patients with anti-EBV VCA IgG/IgM antibodies,the expressions of EBV genes in these PBMCs were increased to different degrees,and there was a significant difference in the expressions of EBV latent genes LMP1,LMP2 and EBNA-1 as well as EBV replicative genes BCRF1 and BLLF1 between the patient-derived and control-derived PBMCs（allP<0.05）.Conclusions There is an aberrant expression of EBV genes in children with SLE,and EBV genes may contribute to the development of SLE.

Lupus erythematosus,systemic;Epstein-Barr virus infections;Gene expression;Child

系统性红斑狼疮（SLE）是累及全身多系统的自身免疫性疾病，表现为T、B淋巴细胞异常活化和大量自身抗体产生［1］。儿童SLE通常临床表现较严重，起病时急而重，是儿童时期预后较差的一种疾病。近年来SLE的病毒病因学研究受到高度重视，Epstein-Barr病毒（EBV）感染与SLE发生发展的关系已成为研究的热点［2-3］。EBV具有嗜B淋巴细胞的特性，对机体免疫系统造成持续和慢性刺激，EBV在体内存在潜伏感染和裂解感染两种形式［3］。潜伏感染只表达潜伏基因：包括EBV核抗原（EBNA），潜伏膜蛋白（LMP）；裂解感染主要表达即刻裂解基因（BZLF1）、晚期裂解基因（BCRF1、BLLF1）等。本研究通过研究儿童SLE患者中外周血单一核细胞（PBMC）及用分泌EBV的细胞上清液培养PBMC后EBV的表达，探讨EBV在儿童SLE中的发病机制。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.006

海南省自然科学基金（814314，309079）

510015广州，南方医科大学研究生院［丁艳（现在海南省妇幼保健院，570206海口）］；中南大学湘雅二医院儿童医学中心小儿肾脏专科（何小解、党西强、易著文）；海南省人民医院心内科（廖旺）；广州军区总医院皮肤科（杨慧兰）；海南省妇幼保健院皮肤科（向伟）

杨慧兰，Email：huilany88@hotmail.com；向伟，Email：xiangwei@163.com

2014-08-05）

（本文编辑：吴晓初）