利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血单一核细胞的影响

王媛媛 胡明洁 张静 黄银久 汤必奎 陈昌杰 吴守伟

利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血单一核细胞的影响

王媛媛 胡明洁 张静 黄银久 汤必奎 陈昌杰 吴守伟

目的 探讨利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素激活特应性皮炎患者单一核细胞的影响。方法抽取6例特应性皮炎患者外周血，常规分离培养单一核细胞。以金黄色葡萄球菌外毒素刺激共孵育，同时加入不同浓度的利多卡因。3H-TdR掺入法检测单一核细胞增殖，酶联免疫吸附法（ELISA）检测Th1和Th2细胞因子的释放。Western印迹法检测利多卡因对与中毒性休克综合征毒素1（TSST-1）刺激的特应性皮炎患者单一核细胞共孵育的HaCaT细胞中间丝相关蛋白的表达。结果 TSST-1（100 μg/L）显著刺激了特应性皮炎患者单一核细胞的增殖（SI=75± 2.12，P<0.05），并刺激 α 肿瘤坏死因子、γ干扰素、白细胞介素（IL）2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-13细胞因子的释放（均P<0.05）。CCK-8检测结果显示，与空白对照组相比，100 μmol/L利多卡因显著抑制了TSST-1刺激的特应性皮炎患者单一核细胞的增殖（SI=58±3.14，P<0.05），亦显著抑制了TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血IL-4、IL-5、IL-13、α肿瘤坏死因子以及γ干扰素的释放，差异有统计学意义（均P<0.05）。Western印迹法结果显示，100 μmol/L利多卡因阻断了HaCaT细胞中间丝相关蛋白表达的下调，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 利多卡因对TSST-1刺激的特应性皮炎患者单一核细胞的激活具有明显的抑制作用。

特应性皮炎；金黄色葡萄球菌；外毒素类；利多卡因；单核细胞

资料和方法

一、资料

盐酸利多卡因和TSST-1均购于美国Sigma公司，IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）和SDS-PAGE蛋白样本上样缓冲液（5X）均购于上海碧云天生物技术研究所。DMEM-高糖细胞培养基，胎牛血清和无血清原代人表皮角质形成细胞培养基和胶原酶II均购于美国Gibco Brl公司。中间丝相关蛋白（FLG）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。HaCaT细胞购于武汉大学保藏中心，细胞因子ELISA检测试剂盒购于上海博谷生物科技有限公司，Transwell装置购于美国Becton Dickinson公司。

二、对象

2013年8月至2014年3月，在蚌埠医学院附属第一医院皮肤科门诊确诊的6例AD患者（10～68岁，平均28.55岁），均符合Hanifin-Rajak诊断标准［7］，SCORAD 评分 5～57.6，平均 38.27。6 例患者在纳入本研究前2周内均未服用糖皮质激素、未接受免疫抑制剂治疗以及局部未应用糖皮质激素类药物。本研究已通过本院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

三、方法

1.PBMC的分离纯化：无菌采集静脉血10 ml注入盛有10 ml D-Hanks液（含2.5%的枸橼酸钠200 μl）的试管中混匀，用 Ficoll Hypaque 分离方法进行分离。分离后将细胞接种于培养瓶中，置37℃，5%CO2培养箱2～4 h后吸出培养基，用37℃预热的培养基清洗3遍，将未贴壁细胞洗脱。待细胞生长至80%～90%单层融合状态时，给予无血清培养基静止12 h以上，然后给予不同处理。

2.利多卡因对PBMC的细胞毒性检测：PBMC（105细胞/孔）铺96孔板，每孔设3复孔，待细胞贴壁 2 h 后，加入不同浓度（0、10、100、1 000 μmol/L）利多卡因，同时设加入PBS的空白对照组，培养7 d，之后，每组取3孔，向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液，37℃下孵育4 h。随后采用酶标仪于波长在450 nm处检测吸光度A值，650 nm作为参考波长进行双波长测定。

3.细胞增殖和细胞因子检测：分离的PBMC（105细胞/孔）分别以 TSST-1（100 μg/L）或豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）和钙离子载体刺激，同时加入不同浓度的（0、10、100、1 000 μmol/L）利多卡因，同培养7 d。用3H-TdR掺入法测定淋巴细胞增殖：每孔加入 0.5 ～ 1 μCi的3H-TdR（50 μl）继续培养6 ～ 12 h，离心吸去上清液，用200 μl冷PBS洗涤1次（15 000×g离心10 min）。用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品，于玻璃纤维素膜上，蒸馏水抽洗至少2次；滤膜于60～80℃，30 min烘干（或75℃烤箱过夜），然后将滤膜放入装有5 ml闪烁液中（贴细胞的面朝上），闪烁瓶暗处放置15 min；Beckman LS-9800型液体闪烁计数仪计数（测定放射性cpm值）。

4.共培养实验：HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清，1%青链霉素的DMEM培养基中，采用高钙培养环境（CaCl2，10 mmol/L）上调FLG的表达。角质形成细胞和T细胞共培养体系共培养体系：用内置0.4 μm聚碳酸酯膜的 Transwell装置共培养HaCaT-PBMC。HaCaT细胞（105/ml）接种于12孔Transwell培养板下室，PBMC（2 × 106/ml）接种于 12孔Transwell培养板上室。在共培养体系内，先以含庆大霉素（40 mg/L）、10%人AB血清的1640培养基培养48 h；随后用PBS洗涤1次，加入无血清培养基继续培养 24 h；将 TSST-1（100 μg/L）加入 Transwell装置上室的 PBMC，同时加入不同浓度（0、10、100、1 000 μmol/L）的利多卡因，设空白对照组，培养72 h，将未接受TSST-1的刺激PBMC共培养的HaCaT细胞作为对照。

5.RNA的抽提和分析：收集HaCaT细胞离心后留下细胞团块和适量上清（2×106细胞/100 μl），充分振荡直至无细胞团块。取100 μl放入微量离心管中。按RNA抽提试剂盒说明书抽提总RNA，冰上配制RT反应液，建立20 μl反应体系，用DNA扩增仪进行逆转录。用荧光实时定量PCR检测FLG表达（以β肌动蛋白为内参照）。引物序列：FLG：正向5′-CAAATCCTGAAGAATCCAGATGAC-3′，反向 5′-TGCTTGAGCCAACTTGAATACC-3′；β 肌动蛋白：正向 5′-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3′，反向 5′-AGGG TGAGGATGCCTCTCTT-3′。

6.Western印迹分析：细胞总蛋白的提取：细胞刺激结束后用冰PBS洗1次，每孔加入100 μl细胞裂解液RIPI，冰上裂解30 min，收集至1.5 ml离心管，4℃ 15 000×g离心15 min，收集上清液，测定蛋白含量。每个样品取30 μg进行电泳，电压调节至75 V，待条带至分离胶处时调节电压至110 V。将PVDF膜放入以TBST做稀释液的一抗（FLG工作浓度 1∶500，β 肌动蛋白抗体工作浓度 1∶1 000），置于4℃结合过夜。过夜的PVDF膜以TBST清洗3次，每次10 min；将膜放入辣根过氧化酶标记二抗（羊抗兔、羊抗小鼠IgG抗体工作浓度1∶2 000）孵育1 h，TBST洗膜3次 ×10 min；ECL显色，观察结果。

结 果

一、细胞活力检测

CCK-8法检测结果表明，利多卡因在100 μmol/L时对AD患者PBMC的活力无明显影响，在1 000 μmol/L时显著影响AD患者PBMC的活力（图1）。因此，后面的实验利多卡因均采用 ≤100 μmol/L的剂量。

二、利多卡因对TSST-1诱导的AD患者PBMC增殖的影响

图1 利多卡因对特应性皮炎患者外周血单一核细胞细胞活力的影响

图2 利多卡因对中毒性休克综合征毒素1（TSST-1）和豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）+钙离子载体刺激的6例特应性皮炎患者外周血单一核细胞的增殖反应

图3 利多卡因对中毒性休克综合征毒素1刺激的特应性皮炎患者外周血单一核细胞释放白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13、肿瘤坏死因子（TNF）α、干扰素（IFN）γ、IL-2、IL-10及 IL-12的影响

结果显示，100 μmol/L的利多卡因显著降低了TSST-1刺激的AD患者PBMC的增殖（图2，P<0.05）。100 μmol/L的利多卡因同样可以抑制PMA和钙离子载体刺激的AD患者PBMC的增殖。

图4 利多卡因显著抑制与中毒性休克综合征毒素1激活的特应性皮炎患者单一核细胞共孵育的HaCaT细胞内中间丝相关蛋白

三、利多卡因对TSST-1诱导的AD患者PBMC部分炎症因子的影响

检测结果表明，TSST-1显著诱导了AD患者PBMC细胞因子的释放，其中包括以下细胞因子：肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、干扰素 γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-13。利多卡因（100 μmol/L）显著抑制了TSST-1诱导的AD患者PBMC 内 IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α 和 IFN-γ 的产生（P<0.05），但对 IL-2、IL-10 和 IL-12的释放无显著影响（图3）。

四、利多卡因显著抑制了与TSST-1激活的AD患者PBMC共孵育的HaCaT内FLG表达的下调

与TSST-1激活的AD患者PBMC共孵育的HaCaT细胞内FLG蛋白的表达较单独培养的HaCaT细胞内FLG蛋白的表达明显下调，P<0.01。在上述共培养体系内，利多卡因（100 μmol/L）显著阻断了TSST-1激活的AD患者PBMC诱导的HaCaT细胞FLG蛋白的下调（图4）。

讨 论

AD患者的皮损处常出现可产生金葡菌超抗原的金葡菌定植［1-4］。近期研究发现，AD患者的皮肤宿主CD4+Foxp3+T细胞，经金葡菌超抗原刺激后，表现出类似于Th2细胞样的功能，这一过程可能加剧了AD［5］。金葡菌超抗原还具有通过刺激抗原提呈细胞扩大抗原特应性的Th1细胞免疫反应的能力，可能与AD患者慢性期免疫反应有关［2，6-7］。金葡菌超抗原还可以通过上调与人表皮角质形成细胞直接接触的记忆型T细胞比率来参与AD的发病进程，这类T细胞可以迁移至皮损处，随后被激活。目前研究发现，T细胞和单一核细胞释放的TNF-α、IL-4和IL-13可以显著下调人表皮角质形成细胞内FLG的表达，可能导致了皮肤屏障功能的缺陷［8-11］。

在本研究中，我们观察了利多卡因对TSST-1刺激的AD患者PBMC的增殖和细胞因子产生的影响。另外，通过FLG在与SE激活的AD患者PBMC共孵育的人表皮角质形成细胞细胞系HaCaT细胞内的表达，验证利多卡因是否可抑制TSST-1对AD患者PBMC的激活，以此为利多卡因作为抗炎而非麻醉药物治疗AD提供理论依据。我们首次发现，利多卡因（100 μmol/L）可以显著抑制TSST-1刺激后的AD患者PBMC的增殖。另外，利多卡因（100 μmol/L）还显著抑制了TSST-1诱导的AD患者PBMC部分Th1细胞因子和Th2细胞因子的释放。上述研究提示，利多卡因对免疫细胞可能具有免疫调节作用。我们模仿体内的环境，通过在与TSST-1共同刺激的AD患者PBMC共培养的HaCaT细胞内FLG的表达，来检测利多卡因是否可以抑制AD患者PBMC的激活。我们的研究结果显示，利多卡因可以明显阻断与TSST-1共同刺激的AD患者PBMC共培养的HaCaT细胞内FLG的下调。我们认为这与利多卡因能够显著抑制激活的AD患者PBMC释放TNF-α、IL-4和IL-13有关。本文研究结果提示，利多卡因对金葡菌外毒素激活的炎症性T细胞可能具有抑制作用，或许有助于皮肤屏障功能的修复。

糖皮质激素是临床上常用的一种治疗AD的药物。在AD的治疗中，目前糖皮质激素药物由于其对皮肤屏障带来的负面影响正在受到质疑。局部应用糖皮质激素类药物可能导致皮肤屏障恢复延迟，表皮变薄甚至导致抗菌肽的严重下调［12-14］。本研究表明，利多卡因对金葡菌外毒素激活的AD患者PBMC具有抑制作用，并表现出修复皮肤屏障功能的潜力。利多卡因或许可作为一种新的治疗AD的药物进行研发。

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Effects of lidocaine on peripheral blood mononuclear cells from patients with atopic dermatitis stimulated by theStaphylococcus aureusexotoxin TSST-1

Wang Yuanyuan,Hu Mingjie,Zhang Jing,Huang Yinjiu,Tang Bikui,Chen Changjie,Wu Shouwei.Department of Biological Sciences,Bengbu Medical College,Bengbu 233030,Anhui,China

Wu Shouwei,Email:nlicau@126.com

Objective To investigate the effect of lidocaine onStaphylococcus aureusexotoxin-stimulated peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）from patients with atopic dermatitis （AD）.Methods Peripheral blood samples were collected from 6 patients with AD,and PBMCs were isolated by a routine method.Then,the PBMCs were stimulated by theStaphylococcus aureusexotoxin toxic shock syndrome toxin-1 （TSST-1）in the absence or presence of lidocaine at varying concentrations.The3H-TdR incorporation method was performed to detect the proliferation of monocytes,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to quantify the levels of T helper type 1 （Th1）and Th2 cytokines released by PBMCs.Human HaCaT keratinocytes were co-cultured with lidocaine-and TSST-1-stimulated PBMCs from patients with AD for 72 hours,then,Western blot was conducted to examine the expression of filaggrin protein in HaCaT cells.Results TSST-1（100 μg/L）significantly enhanced the proliferation of PBMCs from patients with AD （stimulation index=75±2.12,P<0.05）,as well as the release of tumor necrosis factor-α（TNF-α）,interferon（IFN）-γ,interleukin（IL）-2,IL-12,IL-4,IL-5 and IL-13 by the PBMCs（allP<0.05）.Compared with the blank control group,100 μmol/L lidocaine significantly inhibited the TSST-1-stimulated proliferation of PBMCs from patients with AD （stimulation index=58±3.14,P<0.05）,as well as the release of IL-4,IL-5,IL-13,TNF-α and IFN-γ by the stimulated PBMCs （allP<0.05）.Western blot showed that 100 μmol/L lidocaine significantly blocked the down-regulation of filaggrin expression in HaCaT cells （P<0.01）.Conclusion Lidocaine has a significant inhibitory effect on the activation of TSST-1-stimulated PBMCs from patients with AD.

Atopic dermatitis;Staphylococcus aureus;Exotoxins;Lidocaine;Monocytes特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）患者常出现 金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）定植，且皮损处较非皮损处定植明显［1-2］。金葡菌能够释放外毒素，中毒性休克综合征毒素1（toxic shock syndrome toxin,TSST-1）是其中最主要的一种，具有超抗原的特性，可以结合主要组织相容性Ⅱ类分子，低选择性地激活表达某些受体Vβ链家族的T细胞。TSST-1可通过诱导T细胞增殖和细胞因子释放的方式诱发或加重AD患者的皮炎［3］。研究发现，与健康对照相比，TSST-1可刺激AD患者外周血单一核细胞（PBMC）释放更多的 Th2 细胞因子［4］。文献［5］报道，利多卡因具有抗炎作用，在过敏性疾病的治疗中可作为免疫调节类药物使用。最新研究发现，利多卡因可以显著抑制金葡菌外毒素SEA和SEB刺激的AD患者PBMC的激活，但金葡菌其他类型的外毒素对其影响尚未见报道［6］。在本研究中，我们研究了利多卡因对TSST-1刺激的AD患者PBMC的增殖和细胞因子产生的影响。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.010

安徽省高校省级优秀青年人才基金重点项目（2013SQRL050ZD）；蚌埠医学院科技发展基金（Bykf13A01）

233030安徽，蚌埠医学院生物科学系

吴守伟，Email：nlicau@126.com

2014-03-30）

（本文编辑：吴晓初）