2型糖尿病视网膜病变与DNA氧化损伤的关系

葛维明 卞茸文 陈吉海 陈慧梅 杜宏

2型糖尿病视网膜病变与DNA氧化损伤的关系

葛维明 卞茸文 陈吉海 陈慧梅 杜宏

目的 了解2型糖尿病合并糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）患者中机体DNA氧化损伤水平。 方法 选择87例2型糖尿病患者，采用眼底检查方式明确是否患有视网膜病变，然后将其分为糖尿病DR组和无DR组，DR组31例，其中男11例，女20例，平均（67.68±6.61）岁，无DR组56例，其中男24例，女32例，平均（65.91±3.91）岁，同时选择65例正常体检者为对照组。测定血清单核细胞DNA氧化损伤指标8羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）水平，比较3组之间血清8-OHdG水平。 结果 糖尿病组较对照组血8-OHdG水平升高，2组有统计学差异［（3.23±1.86）ng/ml比（0.72±0.93）ng/ml，t=9.972，P＜0.001］，DR组较无DR组血8-OHdG水平升高，2组间有统计学差异（t=2.441，P=0.017）。Speaman相关性分析显示，患者视网膜病变的严重程度与血清8-OHdG水平呈正相关。 结论 2型糖尿病患者机体DNA氧化损伤指标8-OHdG水平增高，合并DR的患者，8-OHdG水平增高更明显，而且与DR的病变程度呈正相关，DNA氧化损伤可能不仅参与糖尿病发病，还与糖尿病的微血管并发症的发病有关。

2型糖尿病；糖尿病视网膜病变；8羟基脱氧鸟嘌呤；氧化损伤

目前研究认为2型糖尿病与机体DNA氧化损伤密切相关，DNA的氧化损伤在糖尿病慢性并发症的发病中亦起着重要的作用，而 8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）是DNA氧化损伤敏感的生物指标，与机体氧化应激水平呈正相关［1］。目前糖尿病视网膜病变（DR）与DNA损伤水平的研究较少，为了明确DR与氧化应激的关系，本研究对比了糖尿病合并DR组、糖尿病无DR组以及正常对照组血清8-OHdG的水平，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取2013年1～6月江苏省省级机关医院内分泌科87例2型糖尿病患者为糖尿病组，其中男43例，女44例；年龄60～80岁，平均（68.58±8.07）岁；病程2～12年，平均糖尿病病程（108.12±84.36）月。同时将糖尿病组又分为DR组（31例）和无DR组（56例）。并纳入65例健康体检者为正常对照组，男35例，女30例，年龄60～80岁，平均（69.17±7.09）岁。入选对象均签署知情同意书。DR诊断采用眼底检查方式明确，分期参考中华医学会眼科学分会眼底病学组制订的国内DR分期标准，进行6级分期［2］。

1.2 患者入选标准 （1）年龄＞60岁、不吸烟的2型糖尿病患者；（2）DR为眼底检查方法明确提示有DR1期及1期以上改变；（3）高血压患者入选前平卧位血压＜180/110 mmHg。排除标准：（1）吸烟；（2）长期使用维生素C、维生素E等抗氧化剂；（3）长期使用降血脂类药物；（4）长期使用其他影响机体氧化应激状态的药物；（5）长期使用非甾体类抗炎药、激素或免疫抑制剂治疗；（6）严重肝功能障碍（丙氨酸氨基转移酶或天门冬氨酸氨基转移酶高于正常上限2倍）；（7）经尿检、肾脏穿刺活检等排除其他尿蛋白升高疾病（急、慢性肾小球肾炎等）；（8）合并有冠状动脉硬化性心脏病、脑血管疾病等大血管并发症患者。本研究得到江苏省省级机关医院伦理委员会的批准。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA：对于符合条件的2型糖尿病患者抽取5～10 ml空腹静脉血，使用盐析法提取DNA。

1.3.2 DNA浓度的计算和纯化：DNA在TE缓冲液［100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0］中溶解至20～50μg/ml；分别于230 nm、260 nm、280 nm 3个波长检测吸光度，并计算DNA的浓度（在波长为 260 nm条件下，1.0对应于50μg/ml DNA），了解DNA的纯度［参考：（260 nm的吸光度）/（280 nm的吸光度）=1.8/1.85；（260 nm的吸光度）/（230 nm的吸光度）=2.2/2.25］。

1.3.3 DNA的酶消化：溶解200μg DNA至135μl水中；加入15μl乙酸钠（200 mmol/L，pH 4.8）、6 U的核酸酶P1（15μl，1mg/ml）至DNA溶解液中，氩气环境下37℃下孵育30 min。然后加入1 mol/L Tris-HCl缓冲液（15μl，pH 7.4）及2 U碱性磷酸酶（7μl，200 U/0.7 ml，pH 7.4），继续在氩气环境下37℃下孵育30 min。水解产物过纯化柱，以去除酶及其他大分子，14 000 r/min离心10 min。收集离心的液体，取50μl DNA消化产物用于ELISA试剂盒检测。

1.3.4 ELISA试剂盒检测：使用 ELISA试剂盒（IMKOGNW 050915E，Catalog No.KOG200S/E）检测提取的DNA中8-OHdG的含量。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0统计学软件，计量数据用均数±标准差表示，2组之间比较采用两独立样本均数的t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，非参数检验采用秩和检验，相关性分析采用Speaman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组基线资料 3组间年龄、性别、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等差异均无统计学意义，同时糖尿病合并DR组与无DR组间糖化血红蛋白（HbA1c）、病程差异均无统计学意义（P＞0.05）。3组间DNA浓度和纯度差异也没有统计学意义（P＞0.05）。3组间具有可比性，见表1。

表1 3组基线资料比较

表1 3组基线资料比较

项目 糖尿病组DR组（n=31） 无DR组（n=56）正常对照组（n=65） F P HbA1c（%） 7.98±2.69 7.63±1.69 — 1.985 0.138 TC（mmol/L） 5.26±2.54 4.80±1.26 5.02±1.13 0.956 0.418 LDL-C（mmol/L） 3.60±2.35 2.97±0.88 3.12±1.34 1.467 0.192 DNA浓度（μg/ml） 28.76±2.65 27.66±3.65 28.43±2.79 0.289 0.885 DNA纯度（A260 nm/A280 nm） 1.84±0.26 1.82±0.17 1.83±0.35 0.133 0.957

2.2 血清8-OHdG水平 正常对照组血8-OHdG水平为（0.72±0.93）ng/ml，糖尿病组血8-OHdG水平为（3.23±1.86）ng/ml，2组比较有统计学差异（t= 9.972，P＜0.01）。糖尿病DR组血清8-OHdG水平较无DR组显著升高［（3.86±2.03）ng/ml比（2.87± 1.67）ng/ml］，差异有统计学意义（t=2.441，P= 0.017）。

2.3 DR严重程度与血清8-OHdG水平的相关关系按照DR 6级分期（1～6期）将DR组患者进行分期，并将患者视网膜病变的严重程度与血清8-OHdG水平进行相关性分析。Speaman相关性分析显示，DR分期与血清8-OHdG水平呈显著正相关（r=0.436，P＜0.01）。DR分型及分期：Ⅰ期：视网膜有微动脉瘤或并有小出血点；Ⅱ期：视网膜有黄白“硬性渗出”或并有出血斑，见图1；Ⅲ期：视网膜有白色“软性渗出”或并有出血斑。此3期统称为单纯型DR。眼底表现为视网膜微血管瘤，视网膜出血斑，见图2。Ⅳ期：视网膜有新生血管和（或）玻璃体出血；Ⅴ期：视网膜有新生血管和纤维增殖，Ⅵ期：视网膜有新生血管和纤维增殖并发现网膜脱离，后3期统称为增殖型DR，指病变至少有部分向内延伸超过内界膜，表现为新生血管、纤维性增殖和牵引性视网膜脱离。

图1 DRⅡ期伴出血点、微血管瘤和硬性渗出线

图2 DRⅢ期伴视网膜出血斑

2.4 受试者工作特征曲线（ROC）分析 将血清8-OhdG水平和DR进行ROC分析，希望能得到对DR有诊断价值的血清8-OhdG水平的切点。ROC分析提示曲线下面积为0.738，提示具有较好的准确性。约登指数［敏感度-（1-特异度）］最大值为0.542，对应8-OhdG水平为1.17 ng/m l，其敏感度为100%，特异度为45.8%。

3 讨论

3.1 氧化应激被认为是糖尿病微血管并发症的重要发病机制之一［3-4］。在糖尿病患者中，DNA的断裂、嘧啶环的氧化及嘌呤位点的改变均较正常对照组明显升高，而这些改变和氧化应激有着重要联系［5］。在高糖环境中，一方面，体内抗氧化酶表达受到抑制［6］；另一方面，由线粒体电子传递链生成的电力学梯度及感光细胞等产生的活性氧（ROS）和超氧自由基增多［7-8］；过多的ROS可以直接介导DNA的损伤［9］，同时还可激活与糖尿病微血管病变有关的己糖胺途径、多元醇通路等，并可使氧化性更强的过氧化硝酸盐合成增加，从而使硝化酪氨酸水平增高，造成DNA的损伤和组织细胞的凋亡，进一步促进了糖尿病微血管并发症的发生发展［10］。

3.2 8-OHdG是DNA中鸟嘌呤氧化损伤的特异产物。在氧化应激状态下，DNA链上的碱基鸟嘌呤C-8位受羟自由基及单线态氧的攻击发生羟化，而羟化的鸟苷酸可被机体特异性DNA修复酶剪切，形成稳定的代谢产物8-OHdG，该物质因此也被认为是内源性氧自由基引起DNA损伤的标志［11］。

3.3 本研究探讨了糖尿病组与正常对照组间、糖尿病DR组与糖尿病无DR组间血液单核细胞DNA提取液中8-OHdG水平的差异。结果显示，糖尿病组与正常对照组相比，血8-OHdG显著升高，证实糖尿病患者机体DNA氧化损伤较正常对照组明显增多。此外，糖尿病合并DR组与糖尿病无DR组相比，血8-OHdG水平亦明显升高，提示在糖尿病患者中，其氧化应激水平也不尽相同。在合并慢性并发症阶段，其体内氧化应激水平较非糖尿病并发症阶段显著升高。此外Speaman相关性分析显示，DR分期与血清8-OHdG水平呈显著正相关。上述结果提示，氧化应激不仅参与了糖尿病及DR的发病，同时也可能在糖尿病慢性并发症的发生发展中起到重要的作用。

3.4 对于DR而言，8-OhdG水平有一定的提示和参考价值，但尚不能作为一个较好的诊断指标，本研究对DR与血清8-OhdG水平进行ROC曲线分析时发现，虽然曲线下面积＞0.7，具有较好的诊断价值，但通过计算约登指数后发现，随访切点的敏感性较高，但特异度较低，此结果也需待我们以后扩大试验样本后进一步论证。而且在进行血糖及血脂等方面比较时，我们发现，虽然各组间血糖及血脂无统计学差异，但DR组血糖及血脂均较无DR组略有升高，提示这种氧化应激水平的增加可能与血糖及血脂的升高有一定关系，但由于研究样本的限制，2组间差异未见统计学意义，希望在以后的工作中，继续扩大样本量，增加上述假设的证据。

3.5 本研究证实DNA氧化损伤在糖尿病DR组病人中较正常对照组及糖尿病无DR组明显升高，为抗氧化治疗在临床的应用提供了依据。与以往以尿液作样本相比，本试验所采用的静脉抽血提取样本的方式更为方便；并且，本试验采用ELISA检测方法，较目前的高效液相色谱法电化学检测法特异度、灵敏度更高。这些既利于现场及大型人群分析，同时也能排除尿液中多种代谢产物及杂质对结果的干扰。

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Relationship between diabetic retinopathy and oxidative damage to DNA

GEWei-ming.Department ofCarde Health Care；BIAN Rong-wen，CHEN Ji-hai.Department ofEndocrinology，Jiangsu Province Geriatric Hospital，Nanjing 210024，China；CHEN Hui-mei.Medical College of Nanjing University，Nanjing 210093，China；DU Hong.Department of Endocrinology，Nanjing General Hospital ofNanjing Military Command，PLA，Nanjing 210002，China

Objective To investigate the level of DNA oxidative damage in the patients with diabetic retinopathy （DR）. M ethods Eighty-seven patientswith type 2 diabetesmellitus（T2DM）were enrolled in this study.According to the results of fundus photo detection，the patients were divided into DR group（31 cases，11 males and 20 females，mean age 61.68±11.61 years）and non-DR group（56 cases，24males and 32 females，mean age 60.91±13.91 years）.Sixty-five normal healthy were enrolled as control group.The level of serum 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine（8-OHdG）was detected and compared between three groups. Results The level of8-OHdG of the patientswith T2DM was higher than thatof the normal healthy（3.23±1.86 ng/ml vs.0.72±0.93 ng/ml，t=9.972，P＜0.001）.The level of 8-OHdG of DR group was higher than thatof non-DR group（t=2.441，P=0.017）.Spearman analysis showed that the level of8-OHdGwas correlated with the severe degree of DR. Conclusions Oxidative damage of DNA is significantly higher in the patientswith T2DM，especially in the patients with DR.It suggests that oxidative damage of DNA might participate in the development of T2DM and themicrovascular disease，which provides reference for the anti-oxidative therapy for T2DM with DR.

type 2 diabetesmellitus；diabetic retinopathy；8-hydroxy-2′-deoxyguanosine；oxidative damage

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.09.007

国家自然科学基金面上项目（71373132）；江苏省科技厅自然研究基金重点项目（BK2010089）；江苏省科技厅自然科学基金（BK2012882）；江苏省省级机关医院院级课题（L200902）

210024 江苏省南京市，江苏省省级机关医院干部保健科（葛维明）；内分泌科（卞茸文，陈吉海）；210093 江苏省南京市，南京大学医学院（陈慧梅）；210002 江苏省南京市，中国人民解放军南京军区南京总医院内分泌科（杜宏）

杜宏，Email：duhong5@tom.com

2014-12-14）