单增李斯特菌在生食鱼片中生长模型的建立

周 晏，周国燕，*，徐 斐，曹 慧，彭少杰，王李伟，李 洁，王 颖

（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市食品药品监督所，上海 200233）

单增李斯特菌在生食鱼片中生长模型的建立

周 晏1，周国燕1，*，徐 斐1，曹 慧1，彭少杰2，王李伟2，李 洁2，王 颖2

（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市食品药品监督所，上海 200233）

为研究生食鱼片中单增李斯特菌的生长规律，将单增李斯特菌接种到经冷杀菌后的3 种生食鱼片（三文鱼片、金枪鱼片、鲷鱼片）中，分别置于4、8、15、25、35 ℃环境下培养，间隔适当时间取出计数。用5 种常用的一级模型（Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型、Richards模型和MMF模型）对实验数据进行拟合，通过比较相关系数R2和均方误差（mean square error，MSE），确定最适一级模型为G ompertz模型。建立单增李斯特菌生长动力学参数（最大比生长速率μm和迟滞期λ）关于温度、pH值和水分活度的二级平方根扩展模型，并应用相关系数R2、偏差值Bf和准确值Af进行验证。结果表明，构建的二级模型能够很好地描述生食鱼片中单增李斯特菌的生长情况。

生食鱼片；单增李斯特菌；生长模型

生食鱼片是指新鲜捕捞的鱼类经过清洗、整理等处理后直接切配食用的生鲜鱼片制品［1］。近年来，随着人们饮食习惯的变化和消费水平的提高，生食鱼片以其美味新鲜、营养丰富、食用方便等特点，受到越来越多消费者的青睐。然而，生食鱼片无需加热烹调过程且富含适合微生物生长繁殖的各种营养物质，其质量安全问题尤其是病原菌控制问题尤显重要。

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是四大食源性致病菌之一［2］，也是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为重点监测对象的食源性致病菌之一，能引 起人畜共患的李斯特菌病［3］。单增李斯特菌除可引起急性食物中毒［4］外，还可引起人和牛羊兔等动物的脑膜炎，婴儿及新生儿的化脓性脑膜炎或心肌炎，胎儿在子宫内感染可导致母体流产或死胎。李斯特氏菌病发病率不高，但十分严重，致死率（20%～30%）远高于其他常见食源性病原菌［5-6］。孕妇、胎儿、新生儿、老年人以及免疫功能缺陷者感染风险较高［7］。这种菌分布广泛、适应能力强，主要通过污染畜禽蛋奶等食物引起人类感染，已成为危害人类健康的主要元凶之一。环境适宜时，单增李斯特菌可在0～4 ℃的低温条件下生长繁殖，鲜有其他致病菌能在此温度下与其竞争，因此，该菌对冷藏食品 的安全 构成了严重威胁，致使冷藏食品容易引发李斯特菌病［8］。生 食鱼 片作为最主要的冷藏食品之一，其安全性很大程度上受到单增李斯特菌的影响。

预测微生物学（predictive microbiology）是一门交叉性综合性学科，主要对微生物的生 长动力学规律做出预测，用数学方法描述食品内微生物在不同条件下生长或失活的动态变化与外部环境因素之间的关系［9］。目前，食品工业中主要应用预测微生物学来确定食品货架期和评估食品安全性［10］。

综上所述，对生食鱼片中单增李斯特菌的生长情况进行研究是十分必要的。目前，生食鱼片中单增李斯特菌的研究还未见报道，此外，绝大多数关于单增李斯特菌生长规律的研究只考虑了影响微生物生长的最主要的因素——温度［11-13］，而其他重要因素，如pH值、水分活度等则未被考虑。本实验在建模过程中同时考虑了温度、pH值和水分活度3 个重要因素，主要研究了5 种不同温度（4 ℃冷藏、8 ℃低温、15 ℃春秋温度、25 ℃常温、35 ℃高温）条件下3 种生食鱼片中单增李斯特菌的动态生长规律，利用软件建立其生长初级模型和二级模型，为评估单增李斯特菌在生食鱼片中的风险以及提高生食鱼片食用安全性提供有效工具。

1　材料与方法

1.1菌种、材料与试剂

单增李斯特菌（ATCC 19115），购于广东省微生物菌种保藏中心。

三文鱼块、金枪鱼块、鲷鱼块，均购自勋鲜馆壹号店。

PALCAM琼脂、PALCAM添加剂1、2，脑心浸出液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；NaCl、KCl、亚铁氰化钾、乙酸锌、硝酸银、硫氰酸钾、硫酸铁铵（均为分析纯）、冰乙酸、石油醚（30～60 ℃沸程）、浓硝酸 国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

YXQ-LS-75SⅡ型灭菌器 上海博讯实业有限公司；SW-CJ-IC型净化工作台、SPX-250B-Ⅱ型生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；HWS-250型恒温恒湿培养箱 上海比朗仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海圣科仪器设备有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海华连医疗器械有限公司；XW-80A型漩涡混合器 上海精科实业有限公司；FA2204B型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；WAECO CF50型冰箱 美国电子（深圳）有限公司。

1.3方法

1.3.1理化指标的测定

pH值测定方法参考GB/T 9695.5-2008《肉与肉制品pH测定》［14］。

由于样品水分活度（aw）测定存在较大误差，因此本实验通过测定NaCl含量（XNaCl/%），由换算公式（1）［15］计算出aw值，NaCl含量测定方法参考GB/T 12457-2008《食品中氯化钠的测定》［16］。

1.3.2生食鱼片的制备

将生鲜鱼块无菌切割成（10.0±0.2）g、5 mm厚的薄片，用75%酒精棉球擦拭鱼片表面，再将鱼片两面各紫外杀菌15 min后，装入无菌袋内备用。

1.3.3菌种的活化

将单增李斯特菌接种于BHI培养基中于37 ℃条件下活化24 h，制得菌种原液。

1.3.4菌液制备、接种、培养及计数

调整菌种原液浓度至108CFU/mL（OD600nm= 0.15），用无菌生理盐水（0.9 g/100 mL）将菌液按1∶10的比例稀释至104CFU/mL。取1 mL菌液用无菌玻璃棒均匀涂抹至鱼片表面，使最终浓度约为103CFU/g，室温下放置5 min，确保细胞黏附于鱼片表面。

将接种后的鱼片分别置于4、8、15、25、35 ℃培养箱中，4 ℃培养12 d，每12 h取样1 次；8 ℃培养10 d，每12 h取样1 次；15 ℃培养5 d，每8 h取样1 次；25 ℃培养4 d，前16 h每4 h取样1 次，之后每8 h取样 1 次；35 ℃培养1.5 d，前3 h每1 h取样1 次，之后每3 h取样1 次。取样测定时，向无菌袋内加入90 mL无菌生理盐水，充分揉捏2 min，取液体适当比例稀释后计数于PALCAM平板。每一温度、每个时间点2 个平行。

1.3.5建模方法

1.3.5.1一级模型的建立

选用5 种常用的一级模型［13，17-18］拟合不同温度下生食鱼片中单增李斯特菌的生长曲线（表1）。其中Baranyi模型应用Combase数据库（http：//modelling.combase.cc）建立，其余4 种模型应用Curve Expert 1.4软件建立。

表1　5 种微生物常用一级模型方程式［13，177--1188］Table 1 Equations of five common primary models［13，177--1188］

通过比较相关系数R2和均方误差（mean square error，MSE）来分析模型的拟合效果。R2越接 近于1，MSE越小，说明模型的拟合效果越好。

1.3.5.2二级模型的建立

常用的二级模型有平方根模型及其扩展式、响应面模型等［18］，由于响应面模型的建立需要大量的数据支持，而可生食的鱼类相当有限，无法满足建立响应面模型 所需的数据量，并且建立得到的响应 面模型只在一定温度范围内符合微生物生长的实际情况［18］，因此，本实验选用平方根模型扩展式建立单增李斯特菌最大比生长速率、迟滞期与温度、pH值、水分活度的二级预测模型，应用统计分析软件Or igin 8.0进行非线性回归分析。二级平方根扩展模型数学描述见公式（7）、（8）。

式中：μm为最大比生长 速率/h-1；λ为迟滞期/h；Tmin为最低生长温度；pHmin为最低生长pH值；awmin为最低生长水分活度；a、b为系数。

1.3.5.3模型验证

通过相关系数R2判定模型的拟合性，同时应用偏差因子（bias factor，Bf）和准确因子（accuracy factor，Af）对模型预测效果进行验证和评价。二者表达式如下［19］：

式中：n为实验次 数。

2　结果与分析

2.1生食鱼片的理化指标

表2　3 种生食鱼片的pH值、NaCl含量和awTable 2 pH， NaCl contents and awof three species of fish fillets

使用SPSS软件对3 种生食鱼片的3 个理化指标分别进行了显著性分析，表2结果显示3 种鱼片的pH值、NaCl含量和aw的差异均极显著（P＜0.01）。

2.2一级模型的建立

将实验数据导入Curve Expert 1.4软件和Combase在线数据库，使用5 种方程进行非线性回归，结果见表3～5。

表3　三文鱼片中单增李斯特菌生长模型相关系数及均方误差Table 3 and MSE of models for Listeria monocytogenes growth insalmon slices

表4　金枪鱼片中单增李斯特菌生长模型相关系数及均方误差Tabllee 44 R2aanndd MMSSEE of models forr Listeria monocytogeenneess growth in tuna slices

表5　鲷鱼片中单增李斯特菌生长模型相关系数及均方误差Table 5 and MSE of models for Listeria monocytogenes growth in tilapia slices

由表3～5可知，5 种模型的相关系数R2都在0.97以上，表明5 种方程均能较好地描述4～35 ℃温度范围内单增李斯特菌在生食鱼片中的生长动态。通过比较5 种模型R2和MSE可知，Gompertz模型的R2相对最接近于1，MSE相对较小，拟合性最好，其次是Logistic模型和Richards模型。由Gompertz模型拟合的不同温度下生食鱼片中单增李斯特菌的生长曲线见图1～3。

图1　Gompertz模型拟合的不同温度条件下三文鱼片中单增李斯特菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of Listeria monocytogenes in salmon slices at different temperatures fitted by Gompertz model

图2　Gompertz模型拟合的不同温度条件下金枪鱼片中单增李斯特菌的生长曲线Fig.2 Growth curves of Listeria monocytogenes in tuna slices at different temperatures fitted by Gompertz model

图3　Gompertz模型拟合的不同温度条件下鲷鱼片中单增李斯特菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of Listeria monocytogenes in tilapia slices at different temperatures f itted by Gompertz model

2.3显著性分析

根据Gompertz模型的拟合参数计算出不同温度条件下3 种鱼片中单增李斯特菌的生长动力学参数，通过将Curve Expert 1.4软件中Gompertz模型的表达式与Gompertz模型的经典表达式相换算，得出计算公式如下。

式中：a、b、c为表1中Gompertz模型拟合参数。拟合得到的拟合参数以及计算得到的生长动力学参数如表6所示。

利用SPSS 软件 对温 度、pH 值和aw对最大比生长速率 μm和迟滞期λ的影响进行了显著性分析，结果表明，温度对最大比生长速率和迟滞期影响极显著（P＜0.01），pH值和aw对最大比生长速率和迟滞期影响显著（P＜0.05）。因此，可以进一步建立显著因素对最大比生长速率和迟滞期的回归方程。

表6　Gompertz模型拟合参数与生食鱼片中单增李斯特菌的生长参数Table 6 Fitting parameters of Gompertz model and growth parameters for for Listeria monocytogenes

2.4二级模型的建立

以温度（T）、pH值、aw为自变量，μm、λ为因变量，用Origin 8.0软件拟合二级平方根扩展模型（2）、（3），得到回归方程如公式（13）、（14）所示：

2.5二级模型的验证

以20 ℃条件下3 种生食鱼片中单增李斯特菌的生长数据作模型验证，将预测值与实测值作比较，验证结果见表7。

表7　模型验证结果Table 7 Validation of the models

偏差因子和准确因子是公认的最有价值的模型验证工具，Bf和Af越接近于1，表示模型的预测效果越好［8］。本研究所得最大比生长率的Bf值为1.009 8，迟滞期的Bf值为0.957 0，均在0.90～1.05之间，说明构建的模型能够很好地预测单增李斯特菌的生长速率及生长状况。本实验所得最大比生长率的Af值为1.064 8，非常接近1，迟滞期的Af值为1.145 1，也较接近1，说明模型较理想。因此，两模型均能够较好地预测4～35 ℃内生食鱼片中单增李斯特菌的最大比生长速率和迟滞期。

3　结 论

本实验研究了4、8、15、25、35 ℃条件下单增李斯特菌在3 种生食鱼片（三文鱼片、金枪鱼片、鲷鱼片，代表不同pH值、aw环境）中的生长规律，建立了生食鱼片中单增李斯特菌的一级模型和二级模型，模型构建时，除了考虑微生物生长最主要的影响因素——温度外，还拟合了pH值和aw这2 个重要因素。综合分析5 种一级模型，发现Gompertz模型在不同温度条件和食品基质下拟合度都较好，是描述生食鱼片中单增李斯特菌生长动力学参数的最适模型。构建的最大比生长速率和迟滞期的二级平方根扩展模型相关系数分别为0.985 2和0.970 3，拟合度均较好。通过偏差因子和准确因子（Bfμm= 1.009 8，Afμm= 1.064 8，Bfλ= 0.957 0，Afλ= 1.145 1）验证了本实验所建立的二级模型能够较 准确地预测生食鱼片中单增李斯特菌的生长状况，模型具有可靠性。因此，所建模型可作为生食鱼片中单增李斯特菌安全性评价的定量依据，并可用于风险分析及相关标准的制定，进而更好地控制生食鱼片加工和物流过程中单增李斯特菌的生长，保障生食鱼片的安全。

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Establishment of Predictive Model for Listeria monocytogenes Growth in Raw Fish Fillets

ZHOU Yan1， ZHOU Guoyan1，*， XU Fei1， CAO Hui1， PENG Shaojie2， WANG Liwei2， LI Jie2， WANG Ying2
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093，China； 2. Shanghai Food and Drug Supervisory Institute， Shanghai 200233， China）

In order to predict the growth of Listeria monocytogenes in raw fi sh fi llets， salmon slices， tuna slices and tilapia slices were disinfected by cold sterilization， inoculated with Listeria monocytogenes， transferred for storage at 4， 8， 15， 25 and 35 ℃， and then counted at appropriate time intervals. Five common primary models （Gompertz， Baranyi， Logistic，Richards and MMF） were applied to fi t the growth curve for L isteria monocytogenes. The correlation coeffi cient （R2） and standard deviation （MSE） were compared to identify Gompertz model as the best fitting model. Extended square-root models concerning growth kinetic parameters （maximum specifi c growth rate and lag period） of Listeria monocytogenes as a function of temperature， pH， water activity （aw） and were developed. The R2， bias value （Bf） and accuracy （Af） were calcula ted to evaluate the established models. The results showed that the secondary models could describe the growth of Listeria monocytogenes in raw fi sh fi llets with satisfaction.

raw fi sh fi llets； Listeria monocytogenes； growth model

TS201.3

A

1002-6630（2015）15-0157-06

10.7506/spkx10 02-6630-201515029

2014-08-17

上海市科委重点攻关项目（11391902000；13391901400）

周晏（1990—），女，硕士，研究方向为食品预测微生物学与微生物风险评估。E-mail：925720085@qq.com

周国燕（1970—），女，副教授，博士，研究方向为食品冷冻冷藏与微生物风险评估。E-mail：346122142@qq.com