鲤鱼中腐败希瓦氏菌生长模型的建立和验证

周 康，杨兆锞，刘书亮，韩新锋

（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

鲤鱼中腐败希瓦氏菌生长模型的建立和验证

周 康，杨兆锞，刘书亮，韩新锋

（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

利用市售鲤鱼中分离鉴定得到的腐败希瓦氏菌进行了生长动力学模型的建立。通过预测微生物学的方法比较Logistic、Gompertz和Baranyi模型的生物学特性和应用特性，对3 种模型所得参数进而构建了二级模型并分别进行了内部和外部验证。结果表明：Logistic、Gompertz和Baranyi模型在内部验证中的r2分别为0.982 4、0.983 6和0.988 4，偏差因子（bias factor，Bf）分别为0.985 0、0.995 0和0.970 0；而外部验证Bf值分别为0.804、1.177和0.826。Baranyi模型在对微生物生长的预测性上不仅准确，而且能够更加有效地进行食品安全预警，在实际的农产品和食品领域具有很好的实用价值。

生长动力学模型；内部验证；外部验证；腐败希瓦氏菌

腐败希瓦氏菌是水产品中最常见的一类腐败菌，在低温中可以存活并生长，不仅能导致食品腐败，还能引起人类患病［1］，严重地影响着水产业及其农副业的生产和销售［2］。因此，如何保证水产品及其农副产品的质量，防止食物中毒就显得尤为重要。一般而言，采用预测微生物学的方法对食品和农产品中的微生物进行预测是现在国内外公认的可行方法之一［3］。

在国内的预测微生物学研究中，多采用Logistic［4］和Gompertz模型［5］，而采用Baranyi模型进行研究的报道还相对较少［6］，而在国外已有大量文献在使用该模型［7-9］，尤其是全球最大的开源微生物预测数据库Combase中也全部都采用Baranyi模型进行拟合回归［10］。因而对这一模型进行深入和全面的研究，了解其生物学意义和数学特性对于实际中应用预测模型进行安全预警是十分必要的。

本实验比较了Logisitc、Gompertz和Baranyi模型，通过内部验证和外部验证发现Baranyi模型具有更好的预测效果和生物学性能，能够为食品和农业中微生物引起的危害起到良好的预警效果。

1　材料与方法

1.1菌种与培养基

腐败希瓦氏菌分离自市售鲤鱼，经生理生化鉴定及分子鉴定为腐败希瓦氏菌，四川农业大学食品学院实验室保藏。经30 ℃活化3 次后用于生长动力学实验。

选用胰蛋白胨大豆肉汤（tryptose soya broth，TSB）培养基和胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基分别作为微生物生长和计数培养基。

1.2方法

将活化好的菌株按10 倍梯度稀释后，以约为103CFU/mL的接种量接种于TSB中培养，选择适当时间取样测定其生长动力学曲线。每次实验取3 个稀释梯度，每个稀释梯度3 个平行。实验所选温度为：4、10、20、30 ℃和37 ℃。

1.3模型的建立

1.3.1一级模型的建立

分别采用Logistic模型（公式（1））、修正Gompertz模型（公式（2））［11］和Baranyi模型（公式（3））［12］对数据进行拟合和比较。采用Microsoft Excel软件中的规划求解以最小二乘法的原理进行拟合。

式中：x（t）为微生物在时间t时的数量（lg（CFU/mL））；A为随时间无限减小时渐进对数值；B为相对最大生长速率/h－1；C为随时间无限增加时菌的增量（lg（CFU/mL））；D为达到相对最大生长速率所需要的时间/h。

其中

式中：y（t）为微生物在时间t时的自然对数值（ln（CFU/mL））；y0为微生物的初始浓度（ln（CFU/mL））；ymax为微生物的最大浓度（ln（CFU/mL））；μmax为最大生长速率/h－1；v为底物限值参数；h0为初始生理状态参数α0的对数形式，

1.3.2二级模型的建立

采用Ratkowsky模型（公式（4））对一级模型所获得的最大生长速率（μmax）进行二级模型的建立。采用Microsoft Excel中的规划求解进行二级模型的建立。

将一级模型求得的μmax和对应的温度变量代入上式中，拟合出模型参数

1.3.3模型的验证

验证采用内部验证和外部验证同时进行。本实验从Combase数据库中选择了基本符合本实验条件的32 组数据进行外部验证，其中25 组是从培养基中获得的数据，7 组是从食品中获得的数据。选择外源数据进行验证，不仅能说明本实验所建模型的准确程度，还能体现模型的安全性，说明其在实际中进行预测的潜在价值。

通过判定系数r2、均方误差（mean square error，MSE）、偏差因子（bias factor，Bf）和准确因子（accuracy factor，Af）来验证模型，公式如下［15-16］：

2　结果与分析

2.1一级模型的建立

腐败希瓦氏菌在4 ℃依然可以缓慢的生长，其生长速率根据Logistic、Gompertz和Baranyi模型求得分别为0.051、0.035、0.042 h－1。在37 ℃时根据Baranyi模型求得的生长速率为0.337 h－1，较30 ℃条件下0.446 h－1缓慢，这也与腐败希瓦氏菌的一般生长情况近似。各一级模型与观测数据拟合情况如图1所示，其判定系数r2均高于0.96，可知3 种一级模型均可很好地对数据进行拟合回归。

图1　腐败希瓦氏菌在不同温度条件下生长曲线及各一级模型拟合曲线Fig.1 Growth curves and predictive model of Shewanella putrefacens at different temperatures

2.2二级模型的建立

使用最大生长速率、延滞期和最大生长量等参数进行二级模型建立的研究已经有很多了，本实验重点在于以内部验证和外部验证方法，来比较3 种一级模型的预测性能和生物学特性，因而仅选择其中最大生长速率进行二级模型的建立，其模型参数如表1所示。

表1　腐败希瓦氏菌在不同温度条件下的二级模型参数Table 1 Parameters of the secondary models

由表1可知，采用Baranyi模型获得的最大生长速率略高于Logistic和Gompertz模型获得的最大生长速率。因此在二级模型的建立时，其Tmin和Tmax都略高于另外两种模型。此外，在二级模型的整体预测中（图2），Baranyi模型也较Logistic和Gompertz模型所预测的最大生长速率快一些，而Gompertz模型则将最大生长速率预测得较慢。

图2　温度对不同一级模型所获得的最大生长速率的影响Fig.2 Effect of temperature on the maximum growth rate estimated from different primary models

2.3模型的验证

2.3.1内部验证

模型验证比较了3 种一级模型的数学和生物学特性。内部验证通过本实验所得数据与所建立的预测模型进行比较，确定和比较各一级模型的准确性和安全性；外部比较是以其他研究者已经发表的数据与本实验所建立的预测模型进行比较，从而确定本研究所得各一级模型的实用性和安全性。验证仅就最大生长速率进行讨论，不涉及其他一级模型中的参数。

表2　腐败希瓦氏菌在不同温度条件下二级模型的内部验证Table 2 Internal validation of the secondary models

由表2可知，r2（0＜r2＜1）越大说明建立的模型与实际测量越接近；MSE（MSE＞0）越小，说明建立的模型与实际测量越接近，但是由于Baranyi模型采用自然对数对数据进行处理，因此其MSE值较Logistic模型和Gompertz模型要高（ln10）2。

Bf是描述观测值所处位置为预测值所构成曲线的上方、下方还是正好在曲线上的参数，同时该值还能度量观测值与预测值之间存在差距的大小，即该模型结构性误差的多少。当该值小于1时，即平均预测值大于平均观测值，说明该模型安全。

Af描述了各观测值所得到的点与预测值构成的曲线之间的平均距离。Af越大说明模型平均准确性越低，当该值为1时说明观测与预测完全吻合，当该值为2时说明预测与观测之差大致为2 h－1［15-16］。

在内部验证中，基于Baranyi模型建立的二级模型具有有更大的r2，其MSE和Af综合起来也优于另外两种模型。此外，由于Bf是预测模型是否安全的重要判断依据［17］，因此，在可接受的范围内，较大的μ预测可以更早地预警某种微生物快速生长所引起的食品危害，达到保证食品安全的目的，因此根据Bf公式可知该值越小其模型越具有预警的效果［18］。

一般认为Bf值在0.90～1.05的范围之内，该模型能够很好地预测微生物生长速率和生长状况；Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范围之内，则该模型是可以被接受的；如果Bf值大于1.15或者小于0.70，则说明该模型是失败的［16］。也有研究者认为，在水产品货架期的预测中，Bf介于0.75～1.25之间也可认为模型是可靠、实用的［19-20］。

2.3.2外部验证

对二级模型的外部验证可以通过其他实验数据来进行，以验证本研究获得模型的安全性，进而知道该模型在生产和监控应用中是否能够具有很好的实用性，也可在一定程度上体现模型的准确性。

图3　腐败希瓦氏菌在不同温度条件下二级模型的外部验证Fig.3 External validation of the secondary models

由图3可知，在以Baranyi模型为基础的二级模型中，散点多分布于对角线上侧，说明基于该模型建立的二级模型所得到的预测值较观测值普遍要大。而Gompertz模型所得散点多分布于对角线下端，说明其预测的μmax较小。基于Logistic、Gompertz和Baranyi模型建立的二级模型在外部验证时，其Bf值分别为0.804、1.177、0.826。说明在安全性上，Logistic和Baranyi模型优于Gompertz模型，而在准确性上，Baranyi模型优于Logistic模型。

3　结 论

本实验针对鲤鱼中的腐败希瓦氏菌采用Logistic、Gompertz和Baranyi模型获得了在不同温度下的μmax，并对μmax进行了二级模型的建立。在本实验的一级模型建立中，3 种模型都可较好地拟合了微生物生长。但是在二级模型的验证中，Baranyi模型的性能要优于其他两种模型，这也与近年来对于Baranyi模型的研究结果相一致［21-22］。本实验通过内部验证和外部验证对3 种一级模型进行比较，在内部验证中，Baranyi模型具有更好的安全性和准确性，在外部验证中Baranyi模型也具有更好的安全性和实用性。

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Modeling and Validation of the Growth of Shewanella putrefaciens from Cyprinus carpio

ZHOU Kang， YANG Zhaoke， LIU Shuliang， HAN Xinfeng
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an 625014， China）

A strain isolated from marketed common carp （Cyprinus carpio）， identified as Shewanella putrefacens by biological and molecular identification methods， was used in the growth modeling study. The obtained data were fitted with three different primary models including Logistic， Gompertz and Banrayi models and the fitted models were validated with coefficients of determination （r2） of 0.982 4， 0.983 6 and 0.988 4， as well as bias factor （Bf） of 0.985 0， 0.995 0 and 0.970 0 in the internal validation and 0.804， 1.177 and 0.826 in the external validation， respectively. The results showed that the Baranyi model not only had a goodness-of-fit， but also could provide effective early warnings of microbial food safety risks. Therefore， the Baranyi model has a great potential for application in agricultural products and foods.

growth kinetic model； internal validation； external validation； Shewanella putrefacens

TS254

A

1002-6630（2015）15-0147-04

10.7506/spkx1002-6630-201515027

2014-09-09

四川省教育厅科研项目（13ZA0265）

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：kang_zhou@163.com