电针百会、神庭穴对MCAO大鼠学习记忆能力及IL-1β、TNF-α表达的影响*

俞坤强　李晓洁　彭洪卫　卓沛元　张颖铮

林晓敏1　林如辉1　陶静1　陈立典1，2，3△

（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.福建康复重点实验室，福建福州350122；3.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州350122）

·研究报告·

电针百会、神庭穴对MCAO大鼠学习记忆能力及IL-1β、TNF-α表达的影响*

俞坤强1李晓洁1彭洪卫1卓沛元1张颖铮1

林晓敏1林如辉1陶静1陈立典1，2，3△

（1.福建中医药大学，福建福州350122；2.福建康复重点实验室，福建福州350122；3.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州350122）

目的观察电针神庭、百会穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆的影响，并探讨其可能的机制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠45只，采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，造模成功后随机分为假手术组、模型组和电针组，各15只。电针组大鼠取神庭、百会穴，电针治疗7 d。各组大鼠在造模后第3天开始采用定位航行实验和空间探索实验检测学习记忆能力；观察各组大鼠神经行为学的表现；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）检测脑梗死体积；苏木素-伊红（HE）染色观察海马区神经元破坏和水肿情况；蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测大鼠左侧海马白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）炎症因子的表达。结果同模型组相比，电针组大鼠学习记忆能力改善（P＜0.05），神经行为学评分降低（P＜0.05），脑梗死体积减小（P＜0.001），海马CA1区神经元破坏情况减轻，IL-1β、TNF-α炎症因子表达降低（P＜0.05）。结论电针能改善局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力，其机制可能与减轻脑内神经元的破坏和水肿、抑制IL-1β、TNF-α炎症因子表达相关。

脑缺血电针学习记忆IL-1βTNF-α

认知障碍作为脑卒中后常见的一种功能障碍，其发病率高达64%［1］，严重影响脑卒中患者的功能恢复，并给患者家庭带来沉重的经济负担［2-3］。针刺治疗用于脑部的疾病，已具有悠久的历史［4］。课题组的前期临床研究也证实，针刺百会、神庭穴，可以有效地改善脑卒中患者的认知功能［5］。认知障碍是一个复杂的病理过程，与海马区神经元的损伤和凋亡密切相关［6］，研究认为炎症反应在脑缺血再灌注后，海马区神经元损伤的病理过程中有重要作用［7］。课题组前期的基础研究证实，针刺可以通过抑制炎症反应从而减轻脑缺血所带来的大脑损伤［8］。故本研究选用百会、神庭穴，观察电针对局灶性大脑中动脉栓塞模型（MCAO）大鼠的学习记忆能力以及与炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的影响。

1　材料与方法

1.1动物Sprague-Dawley大鼠45只，均由福建中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK2012-003，体质量（260±20）g，每笼5只大鼠，均自由进食及饮水，适应性饲养1周。实验过程中均严格按照国际动物保护及使用指南的规定进行。

1.2试剂与仪器水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；苏木精、伊红（福建中医药大学医学实验中心）；Il-1β、TNF-α抗体（Cell Signaling Technology）；β-actin抗体及相应的二抗（北京全式金生物技术有限公司）。Morris水迷宫实验装置及动态图像采集分析系统（中国医学科学院药物研究所）；电针仪（苏州医疗用品厂有限公司）；Bio-Image分析系统（BioRad）；YF-7FB型摊片烤片机（湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）。

1.3分组和造模将SD大鼠随机分成假手术组15只、手术组30只，术前所有大鼠均禁食12 h，经10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，参造Longa法［9］建立局灶性大脑中动脉栓塞模型。大鼠颈部消毒、备皮后，沿着正中线剪开颈部的皮肤，而后钝性分离组织，并将颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉充分暴露，并于近心端结扎颈总动脉，颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，并用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，而后在离颈总动脉结扎处远心端约2～3 mm处剪一小口，将备好的栓线经切口插入，至有少许阻力为止，其插入长度为离颈内、外动脉分叉处约18～22 mm，结扎颈内动脉，常规伤口缝合。待缺血2 h后，退出栓线，造成缺血再灌注模型。实验过程中，密切观察大鼠的变化，注意动物保温。假手术组大鼠只给予分离血管，不结扎和插入栓线。待动物完全苏醒后，参照Zea-Longa法［10］，进行神经行为学评分。0分，无神经缺失的症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向右侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，神经缺失严重，不能自发行走。其中，0分、4分的大鼠予以排除。将合格的大鼠随机分成模型组15只，电针组15只，并分别放回笼中正常饲养。电针组在造模后第2天予电针刺激。取穴百会和神庭，参考《实验针灸学》，采用疏密波，频率为1/20 Hz，电压3～5 V，以大鼠安静耐受、穴位周边组织轻轻抖动为度，每天同一时间开始治疗，每次30 min，每天1次，持续7 d。假手术组和模型组大鼠，不予任何治疗，只给予同等条件的抓取。

1.4标本采集与检测

1.4.1神经行为学评分模型组和电针组大鼠在电针治疗的第1、3、5、7天，参照Zea-Longa法，进行神经行为学评分。

1.4.2水迷宫实验水迷宫实验于干预的第3天开始，总共历时5 d。采用直径、高度分别为120 cm和50 cm，水深为30 cm的圆形水池，水温保持在（22±2）℃。水池划分为4个均等象限，圆形逃逸平台隐匿于任意象限中心位置，直径、高度为6 cm和28 cm，低于水面2 cm，照明设备四周对称。1）定位航行实验：鼠放入水中自由游泳2 min以熟悉周围的环境，而后分别从4个象限顺时针面向池壁放入水中，测定大鼠在90 s的时间内找到平台所需时间，记为逃避潜伏期，由计算机记录各项参数，若大鼠在90 s内未寻找到平台，则牵引大鼠至平台，停留10 s，记录逃避潜伏期为90 s，实验总共历时4 d。2）空间探索实验：电针干预的第7天，撤去平台，经任何一个象限将大鼠面向池壁放入水中，观察在90 s的时间内大鼠穿越原平台所在位置的次数。

1.4.3脑梗死体积检测采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。将快速取得的脑组织置于-20℃冰箱冷冻15～20 min，待脑组织变硬后，从大脑半球额极到枕极，做连续的冠状位切片，切成6片，每片厚约为2 mm。而后将脑片置于1%TTC磷酸缓冲液（pH= 7.4），并放置37℃恒温箱30 min，过程中用毛笔不时翻动脑片，使脑片均匀染色。TTC可与脱氢酶反应而呈现红色，而由于缺血组织内脱氢酶活性下降，故不与TTC反应，从而呈现苍白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析软件，计算梗死面积以及整个大脑面积，然后得出脑梗死体积百分比=（梗死面积和×2 mm）/（全脑面积和× 2 mm）［11］。

1.4.4海马CA1区细胞形态观察麻醉大鼠后，迅速开胸暴露心脏，在心尖剪一小口，灌胃针从开口刺入心脏，调整方向后插入主动脉出口，用止血钳固定灌胃针，而后在右心耳剪一小口，经灌胃针快速注入0.9%氯化钠溶液300 mL，后灌入4%多聚甲醛400 mL固定。快速取脑后，将大脑置于4%多聚甲醛4℃固定24～48 h，在进行梯度脱水、石蜡包埋后，进行冠状切片，片厚约5 μm。脑片在二甲苯中脱蜡、梯度酒精脱水后，行苏木素和伊红（HE）染色，光镜下观察组织的病理变化。

1.4.5海马组织炎症因子表达的检测采用蛋白免疫印迹法。取左侧的海马组织，每100 mg脑组织中加入1 mL的裂解缓冲液和10 μL苯甲基磺酰氟储存液，机械研磨后，13000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。待样品蛋白充分变性后，取样品蛋白50 μg，10%SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜，封闭液室温封闭2 h，分别用Il-1β、TNF-α（1∶1000）、β-actin一抗（1∶5000）孵育，4℃摇床过夜，而后辣根过氧化物标记的二抗（1∶5000）室温孵育1 h。将PVDF膜放图像扫描仪上，使显色液覆盖PVDF膜，利用Im age-lab图像分析系统进行成像和分析。

1.5统计学处理采用SPSS18.0统计软件分析。两组计量资料符合正态分布，则进行两独立样本T检验；不符合正态分布，则进行秩和检验；多组计量资料符合正态分布，则进行单因素方差分析，方差齐者用LSD法，方差不齐则用Games-Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组神经行为学评分比较见表1。模型组大鼠神经行为学评分在各个时间节点明显高于假手术组。MCAO大鼠在经过电针治疗后，神经功能缺损症状得以减轻，评分下降（P＜0.05），说明电针百会、神庭穴，具有治疗作用。

表1　各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

表1　各组大鼠神经行为学评分比较（分，±s）

与模型组比较，△P＜0.05。

组别n电针组8假手术组8模型组8第1天第3天第5天第7天2.25±0.71 1.87±0.35 1.37±0.52 1.13±0.35△0000 2.37±0.74 2.00±0.53 1.75±0.46 1.63±0.52

2.2各组水迷宫实验结果比较见表2、表3。定向航行实验结果表明，随着时间推移，各组大鼠平均潜伏期逐渐缩短，而电针组大鼠的行为学表现明显好于模型组（P＜0.01）；空间探索实验显示，电针组大鼠穿越原平台次数明显多于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明电针百会、神庭穴可以改善大鼠的学习记忆能力。

表2　各组大鼠逃避潜伏期比较（s，±s）

表2　各组大鼠逃避潜伏期比较（s，±s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.001。

组别n电针组8假手术组8模型组8第3天第4天第5天第6天69.84±6.97△52.24±3.72△41.97±9.00△27.28±6.02△32.55±5.1625.47±4.2718.62±4.5714.00±3.93 86.16±3.42*76.69±5.52*68.38±3.20*58.32±7.80*

表3　各组大鼠穿越平台次数比较（次/90 s，±s）

表3　各组大鼠穿越平台次数比较（次/90 s，±s）

与假手术组比较，*P＜0.001；与模型组比较，△P＜0.05。

组别n电针组8假手术组8模型组8次数2.88±0.75△4.38±1.06 1.75±1.04*

2.3各组脑梗死体积比较见表4。与模型组相比较，电针组大鼠脑梗死体积占全脑体积的百分比小于模型组，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。

表4　各组大鼠脑梗死体积百分比比较（%，±s）

表4　各组大鼠脑梗死体积百分比比较（%，±s）

与模型组比较，△P＜0.001。

组别n电针组8模型组5脑梗死体积百分比16.38±2.64△34.88±1.98

2.4各组海马CA1区细胞染色结果见图1。结果显示，假手术组大鼠的神经元排列整齐，细胞结构正常，而模型组大鼠神经元溶解，细胞核固缩，少数神经细胞染色加深，损伤和水肿严重，而电针组大鼠神经元损伤较轻，结构较完整。

图1　各组大鼠海马CA1区细胞形态（HE染色，400倍）

2.5各组海马组织炎症因子表达见图2、表5。与假手术组相比，模型组大鼠IL-1β、TNF-α，表达增加，而电针组大鼠的IL-1β、TNF-α表达较模型组少，表明电针抑制了炎症因子IL-1β、TNF-α的表达。

图2　各组大鼠海马IL-1β、TNF-α表达

表5　各组大鼠海马IL-1β、TNF-α表达比较（%，±s）

表5　各组大鼠海马IL-1β、TNF-α表达比较（%，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别n电针组5假手术组5模型组5 IL-1β/β-ActinTNF-α/β-Actin 53.16±12.54△43.84±5.84△30.97±13.8528.63±4.40 71.98±12.59*70.93±7.67*

3　讨论

认知障碍在中医学古代文献中，多散见于“健忘”“善忘”“呆病”“遗忘”等证中［12］，其病机与神明失养、失用相关，而脑为神明之主，对神明有重要的调控作用。督脉为阳脉之海，其行入络脑，而百会、神庭两穴皆为督脉的要穴，且皆位于脑，具有开窍、醒神、定志之功，故可用于治疗认知障碍［13-14］。郭新荣等［15］在研究针灸治疗颅脑疾病腧穴选取规律中发现，在涉及的经脉中，使用频率最高的为督脉；所涉及的腧穴中，使用频率最高的为百会（68%）。故本研究选取百会、神庭为主穴观察电针对MCAO大鼠的学习记忆功能的影响，且取得较为理想的实验结果。

学习记忆是大脑认知功能的一个重要组成部分，与海马密切相关，有研究认为在细胞水平上，海马与其他区域的神经网络神经元间的突触强度变化是最可能的学习记忆机制［16］。海马作为学习记忆的关键部位，也是脑缺血的敏感区域［17］，当组织缺血时，则会引起海马本身及其周围神经细胞的死亡或者凋亡，导致学习记忆障碍［18］。研究表明，IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放，会引起炎症反应，最终导致海马神经元的损伤［19］。此外，IL-1β、TNF-α被认为是一种“前炎性细胞因子”［7，20］，当其浓度升高时，可以使p38MAPK信号活性增强，而p38MAPK对脑损伤后的神经功能起负性调节作用［21］，最终导致海马区神经元的破坏［22］。另有研究表明，认知功能障碍的发生还与海马区神经元与胶质细胞之间的联系发生障碍相关［23-24］，而由胶质细胞所释放的炎症因子IL-1β、TNF-α在这其中也发挥着重要的作用［25-26］，故炎症因子IL-1β、TNF-α在脑缺血导致的学习记忆障碍的过程中有重要的作用。

本实验中，电针百会、神庭穴可以改善了MCAO大鼠的神经缺损症状和水迷宫实验的行为学表现，说明电针可以改善MCAO大鼠的学习记忆能力。实验结果显示，电针组大鼠脑梗死体积小于模型组，神经破坏和水肿情况好于模型组，且IL-1β、TNF-α等相关的炎症因子的表达也低于模型组，说明电针改善了脑缺血再灌注后的病理损伤。综上所述，电针神庭、百会穴可以治疗MACO大鼠的学习记忆障碍，且这种治疗作用可能与下调IL-1β、TNF-α相关炎症因子表达，减轻神经元损伤相关。然而实验中只采用了水迷宫实验一种行为学评价的方法，存在一定的局限性，在今后的研究中应予以改进。

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Effect of Electro-acupuncture on Learning and Memory Ability and IL-1β，TNF-α Expression in Rats with Cerebral Ischemic/Reperfusion

YU Kunqiang，LI Xiaojie，PENG Hongwei，et al.Kangfu Medicine School of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fujian，Fuzhou 350122，China

Objective：To observe the efficacy of treatment with electro-acupuncture at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）on learning and memory ability in rats after cerebral ischemia/reperfusion（I/R）injury and explore its possible mechanism.Methods：45 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=15），the ischemia group（n=15）and the electro-acupuncture group（n=15）after surgery.The latter 2 groups were modeled as focal cerebral ischemia/reperfusion（I/R）injury，and the electro-acupuncture group received electro-acupuncture at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）for 7 days.The learning and memory ability were tested by Morris water maze；the cerebral infarction volume was measured by TTC staining and image analysis；neurological deficit score was evaluated；the damage and edema of neuron were detected with hematoxylineosin staining，and the protein expression of IL-1β and TNF-α were detected by Western blotting.Results：Compared with the ischemia group，the learning and memory ability improved（P＜0.05）；the neurological deficit score decreased（P＜0.05）；the cerebral infarction volume reduced（P＜0.001）；the neuronal damage reduced，and the expression of IL-1β and TNF-α in hippocampus decreased（P＜0.05）in the electro-acupuncture group.Conclusion：Electro-acupuncture can improve learning and memory ability from cerebral ischemia/reperfusion（I/R）injury in rats，which may be related with reducing the damage and edema of neuron and inhibiting the expression of IL-1β and TNF-α in hippocampus.

Brain ischemia；Electro-acupuncture；Learning and memory；IL-1β；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1891-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.004

2015-06-21）

·研究报告·

科技部国际科技合作项目（2011DFG33240）；福建省自然科学基金项目（2015J01335）；福建省康复技术协同创新中心资助项目（X2012004－协同）

（电子邮箱：cld@fjtcm.edu.cn）