芍药苷预处理激活PPARα对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤保护的作用研究*

郝霁萍　高宇勤△　贺少辉　赵国平

（1.陕西省西安市第九医院，陕西西安710054；2.暨南大学医学院，广东广州510632）

·研究报告·

芍药苷预处理激活PPARα对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤保护的作用研究*

郝霁萍1高宇勤1△贺少辉1赵国平2

（1.陕西省西安市第九医院，陕西西安710054；2.暨南大学医学院，广东广州510632）

目的探究芍药苷预处理通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARα）信号通路对大鼠在体心肌缺血再灌注损伤发挥的干预作用。方法采用结扎SD大鼠心脏LDA的方法建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，利用0.5%Evan’s蓝灌注心肌及1%TTC磷酸缓冲液孵育心肌来观察心肌坏死利用HE染色观察心肌损伤程度，利用酶联免疫吸附法观察大鼠血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、细胞黏附因子（ICAM-1）的含量，蛋白印迹（Western blot）技术检测芍药苷预处理对PPARα的影响。结果芍药苷药物预处理组与缺血再灌注组比较，心肌梗死面积明显减小（P＜0.01）；芍药苷预处理能促进PPARα蛋白的表达，减少血清中TNF-α、ICAM-1的含量。结论芍药苷预处理能减轻大鼠在体心肌缺血再灌注损伤，可能通过增加PPARα蛋白的表达，抑制TNF-α、ICAM-1分泌，减少炎症反应，进而发挥保护作用。

芍药苷心肌缺血再灌注损伤过氧化物酶体增殖物激活受体

缺血再灌注损伤病理过程涉及到炎症反应、氧化应激损伤、凋亡等机制，特别是炎症反应，有研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARα）可以调控涉及到炎症和氧化应激相关的多种转录因子的表达［1-2］。同时发现PPARα的配体贝特类调脂药可以减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤［3-4］。也有实验发现PPARs是NF-κB信号通路的上游调控因子，PPARα活化后可以抑制NF-κB的活化和核内定位，并进一步减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生，减轻炎症反应［4］。芍药苷是单萜糖苷类化合物，是毛茛科植物芍药干燥根中的一种生物活性成分。有研究发现芍药苷对脑缺血损伤具有保护作用［5］。但是对于心肌缺血再灌注损伤研究较少。因此如果芍药苷预处理能减轻心肌缺血再灌注损伤，那么其机制是否可能与PPARα激活相关，为了验证此假说，本实验采用在体SD大鼠冠状动脉前降支（LAD）结扎术模型来观察芍药苷预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌保护作用及与PPARα信号通路的关系。

1　材料与方法

1.1动物SPF级雄性SD大鼠30只，体质量280～400 g，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCXK（粤）2008-0002。

1.2试剂与仪器芍药苷购于南京泽朗医药科技有限公司（批号ZL20090409SYG），抗PPARα（抗鼠一抗）抗体，购自SANTA CRUZ生物技术公司；TNF-α、细胞黏附因子（ICAM-1）试剂盒购置于凯基生物技术公司，其余皆为国产试剂。

1.3分组与给药30只雄性SD大鼠被随机分为3组，每组10只，每组中4只进行心梗面积及缺血面积测定，另外6只进行其他指标测定，3组分别为：假手术组（此组只开胸，但不结扎LAD）、缺血再灌注组、芍药苷预处理组。芍药苷与生理盐水混合，于灌胃前加热溶解混均，药物预处理组大鼠给予芍药苷100 mg/kg灌胃，每日1次，连续灌胃4 d，最后1次于手术前30 min给予。

1.4模型制备将大鼠称体质量，注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，固定大鼠仰卧于手术台，剪除颈部和胸部被毛，碘伏消毒，纵形剪开颈部皮肤约2～3 cm，分离皮下组织及肌肉，显露气管，钝性分离气管并带线，行气管插管，接呼吸机，调整呼吸频率60次/min、通气量20 mL/kg。胸骨左缘3 mm纵形剪开皮肤约4 cm，钝性分离皮下、胸大肌与前锯肌，于三肋间逐步剪开肋间肌，撑开肋骨，撕破心包，显露心脏，确定缝扎位置（肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2 mm，前降支LAD近端位置）。用0号线，叠一个0.8～1 mm的凹槽硅胶管，出针打结结扎LAD，缺血30 min，松开结扎，复灌2 h。模型复制的可靠性用ECGⅡ导联的变化来判断，以ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功。本实验建模总共有4只SD大鼠因为麻醉和手术原因死亡，死亡率13%。

图1　大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立成功的心电图表现

1.5标本采集及检测

1.5.1心肌梗死面积测定实验终点时取出心脏（心脏仍在活鼠身上，未游离），原位结扎左冠状动脉主干，经主动脉逆行灌注（压力为80 mmHg）0.5%Evan’s蓝2～3 mL，立即取心脏，以预冷生理盐水冲洗残余血液，将左室与其他心肌组织分离，快速置于液氮中，取出冷冻心脏，延左室长轴方向连续环切，每片2～3 mm，正常心肌组织为蓝色，缺血区心肌组织为粉色，分离无蓝染缺血区和蓝染非缺血区，滤纸吸干，分别称质量。然后将无蓝染缺血心肌置入1%TTC磷酸缓冲液（pH7.4）中37℃孵育20 min，此时坏死区呈灰白色，非坏死区呈深红色，其后将坏死区和非坏死区分离，滤纸吸干，置于电子天平上称质量。梗死面积以坏死心肌质量与缺血心肌质量（坏死区与非坏死区之和）之比表示。

1.5.2血清TNF-α、ICAM-1检测采用酶联免疫吸附法，再灌注结束后，腹主动脉取血3 mL，收集于非抗凝离心管内，静置30 min，在4℃下以4000 r/min离心10 min，取出上清液，检测血清中TNF-α、ICAM-1的含量，具体操作步骤按照试剂盒说明进行。

1.5.3心肌PPARα蛋白表达检测采用蛋白印迹（Western blot）法，配制分离胶的配制浓度：8%分离胶，制备5%浓缩胶，上液蛋白总量80μg，进行电泳。转膜条件：PPARα蛋白检测用350 mA恒流湿转45 min。一抗孵育条件：anti-PPARα（1∶1000），anti-GAPDH（1∶2000），4℃孵育过夜，二抗（1∶5000）。将Western blot ECL发光液A、B各500 μL等量混合后，涂在PVDF膜上，覆盖胶片，在暗房中，曝光，扫描仪扫描Western blot图像，Quantity one软件分析Western blot条带的灰度值。

1.6统计学处理使用SPSS13.0统计软件处理。实验数据以（±s）表示，组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1芍药苷预处理对心肌梗死面积影响见图2和表1。结果表明，芍药苷预处理组与缺血再灌注组比较，心肌梗死面积明显减小（P＜0.01）。

图2　芍药苷预处理对大鼠心肌梗死面积的影响

表1　各组心肌梗死面积比较（%，±s）

表1　各组心肌梗死面积比较（%，±s）

与缺血再灌注组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别n芍药苷预处理组4假手术组4缺血再灌注组4心梗面积0.14±0.03**0 0.37±0.06

2.2芍药苷预处理对大鼠血清中TNF-α、ICAM-1含量的影响见表2。芍药苷预处理组与缺血再灌注组相比较，能减少TNF-α、ICAM-1的含量（均P＜0.05）。

表2　各组血清TNF-α和ICAM-1水平比较（ng/L，±s）

表2　各组血清TNF-α和ICAM-1水平比较（ng/L，±s）

组别n药物预处理组10假手术组10缺血再灌注组10 TNF-αICAM-1 32.74±4.25*22.08±1.62*22.65±3.12*19.23±1.12*45.84±5.9436.20±3.13

2.3芍药苷预处理对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌PPARα蛋白的影响见图3和表3。结果显示，芍药苷预处理组能促进PPARα蛋白的表达，与缺血再灌注组比较有明显差异（P＜0.01）；说明药物预处理组能明显增加PPARα蛋白的表达。

图3　芍药苷预处理对大鼠心肌PPARα的影响

表3　各组大鼠心肌PPARα表达比较（灰度值，±s）

表3　各组大鼠心肌PPARα表达比较（灰度值，±s）

组别n药物预处理组6假手术组6缺血再灌注组6 PPARα 1.05±0.04**0.64±0.05 0.33±0.03

3　讨论

心肌缺血再灌注损伤的病理过程涉及到炎症反应和氧化应激损伤等机制，此病理过程涉及到多种信号通路调控，其中PPARα就是其中一个重要信号通路。PPARα属于非甾体类核受体超家族，存在于机体大部分组织，有实验发现PPARs是NF-κB信号通路的上游调控因子，PPARα活化后可以抑制NF-κB的活化和核内定位，并进一步减少TNF-α的产生，减轻炎症反应［4］。有研究发现芍药苷对脑缺血损伤具有保护作用［5］。因此本实验提出一个假说：芍药苷预处理减轻心肌缺血再灌注损伤，其机制之一可能与PPARα激活相关。为验证此假说，实验采用在体LAD结扎术模型，通过检测芍药苷预处理对缺血再灌注损伤大鼠心梗面积的影响发现，芍药苷预处理能明显减少模型大鼠心肌梗死面积，而且通过酶联免疫吸附法检测大鼠血清中TNF-α、ICAM-1含量发现，芍药苷预处理能明显降低模型大鼠血清中的TNF-α、ICAM-1的含量。目前研究发现PPARα活化能抑制炎症因子TNF-α、ICAM-1的释放［6］，因此笔者再次假设本实验发现的芍药苷预处理能明显降低模型大鼠血清中的TNF-α、ICAM-1的含量可能与PPARα信号通路激活有关。于是本实验利用蛋白印迹技术检测心肌组织中的PPARα蛋白含量，发现芍药苷预处理能明显升高PPARα蛋白含量，所以通过上述结果认为芍药苷预处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用部分是通过增加PPARα蛋白表达，进而减少炎症因子TNF-α、ICAM-1的表达，最后抑制炎症反应来实现。本实验为芍药苷应用于保护心肌缺血再灌注损伤提供实验基础，为开发干预心肌缺血再灌注损伤的中药制剂提供初步研究。本实验是在体实验，还需要开展芍药苷对原代心肌细胞缺氧复氧模型的影响以进一步探究芍药苷的保护效应是通过全身系统发挥作用，还是局部发挥作用。

［1］Hecker M1，Behnk A，Morty RE，et al.PPAR-α activation reduced LPS-induced inflammation in alveolar epithelial cells［J］.Exp Lung Res，2015，7：1-11.

［2］Yue TL，Bao W，Jucker BM，et al.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha protects the heart from ischemia/reperfusion injury［J］.Circulation，2003，108：2393-2399.

［3］Marx N，Sukhova GK，Collins T，et al.PPARalpha activators inhibit cytokine-induced vascular cell adhesion molecule-1 expression in human endothelial cells［J］.Circulation，1999，99：3125-3131.

［4］Hou G，Yin Y，Han D，et al.Rosiglitazone attenuates the metalloprotease/anti-metalloprotease imbalance in emphysema induced by cigarette smoke：involvement of extracellular signal-regulated kinase and NFκB signaling［J］.Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2015，10：715-24.

［5］Xiaofei Li，Zhibin Wen，Xiaofan He，et al.Effects of cinnamic acid on expression of tissue factor induced by TNF-α in endothelial cells and its mechanisms［J］.J Chin Med Assoc，2006，69（5）：207-212.

［6］Aliaksandr A Bulhak，Christian Jung，Claes-Go，et al.PPARα activation protects the type 2 diabetic myocardium against ischemia-reperfusion injury：involvement of the PI3-Kinase/ Akt and NO pathway［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296：H719-H727.

Effects of Paeoniflorin Pretreatment by Activating PPARα on the Rats with Myocardial Ischemia Reper-fusion Injury

HAO Jiping，GAO Yuqin，HE Shaohui，et al.The Ninth Hospital of Xi′an，Shaanxi，Xi′an 710054，China

Objective：To explore the effects of paeoniflorin preconditioning by activating PPARα on the rats with myocardial ischemia reperfusion injury.Methods：Myocardial ischemia reperfusion injury model was estab lished by cardiac LDA ligation in SD rats.The degree of myocardial injury was observed by perfusion of 0.5% Evan′s blue and 1%TTC.HE staining was used to observe the degree of myocardial injury.The content of TNF-α and ICAM-1 in serum were detected with ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent）.Western blot technology was used to explore the effects of paeoniflorin pretreatment on PPARα.Results：In comparison with ischemic reperfusion group，paeoniflorin pretreatment could decrease infarction area significantly（P＜0.01），reduce the contents of TNF-α and ICAM-1 significantly（P＜0.05）and increase the expression of PPARα.Conclusion：The effect of paeoniflorin preconditioning on rats with myocardial ischemia reperfusion injury may be probably related to the increase of the expression of PPARα and the decrease tof he contents of TNF-α and ICAM-1 in serum

Paeoniflorin；Myocardium ischemia reperfusion injury；PPARα（Peroxisome proliferator-activated receptors alpha）

R285.5

A

1004-745X（2015）11-1888-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.003

2015-08-26）

国家自然科学基金（81173189）；西安市卫生局科技项目；西安市科技项目资助（SF1416）

（电子邮箱：gaoyuqin1234567@aliyun.com）