Aurora-A在胰腺癌的表达及与吉西他滨耐药的相关性研究

何永礼　王欣　施福田　严秋亮　朱锦辉★

Aurora-A在胰腺癌的表达及与吉西他滨耐药的相关性研究

何永礼王欣施福田严秋亮朱锦辉★

目的 探讨Aurora-A的表达与胰腺癌吉西他滨耐药的相关性。方法 qPCR法测定PANC-1和耐药细胞株PANC-1/R2 中Aurora-A mRNA的表达；分别用PANC-1和PANC-1/R2建立胰腺癌动物模型，免疫组化方法测定瘤体Aurora-A的表达。结果 PANC-1组模型第5周肿瘤转移率36.8%（7/19），裸鼠体重（23.2±1.41）g，肿瘤重量（0.453±0.110）g；PANC-1/R2组模型第5周肿瘤转移率50%（9/18），裸鼠体重（22.91±1.13）g，肿瘤重量（0.564±0.203）g。转移率和肿瘤质量两组比较差异有统计学意义。PANC-1组Aurora-A mRNA表达为（1.002±0.040）；PANC-1/R2组Aurora-A mRNA表达为（1.845±0.069），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。PANC-1/R2组18例标本组织中Aurora-A蛋白阳性表达15例（83.3%）；PANC-1组19例组织的Aurora-A蛋白检测阳性表达11例（57.9%），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 Aurora-A基因高表达与胰腺癌细胞株的吉西他滨耐药有关，新方法构建的PANC-1/R2耐药株Aurora-A基因高表达，可用于胰腺癌吉西他滨耐药研究的载体。

Aurora-A激酶 胰腺癌 多药耐药 吉西他滨

胰腺癌是常见的病死率较高的恶性肿瘤之一，化疗效果不理想，作为胰腺癌的首选药物的吉西他滨，其化疗有效率仅25%［1］，多种耐药是导致化疗效果欠佳的重要原因。研究表明Aurora-A激酶作为一种DNA修复功能的蛋白，具有参与修复DNA的作用。目前发现在食道管癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等中，抑制Aurora-A激酶的表达能增强肿瘤的化疗敏感性［2～4］。本文探讨Aurora-A激酶表达与胰腺癌吉西他滨耐药的关系，报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物 雄性BALB/c裸小鼠由浙江中医药大学动物实验中心提供和饲养，鼠龄4周，体质量18～20g，饲养于恒温（25～27℃），恒湿（45%～50%），符合SPF条件的裸鼠室内，饮用水及标准食疗均经灭菌后供动物自由食用。

1.2细胞株 人胰腺癌细胞株PANC-1由浙江大学医学院附属第二医院外科研究所提供。

1.3主要仪器和试剂 qPCR仪（Biorad公司），IS1000凝胶成像系统 （美国法莫西亚公司），Beckman Coul ter Avanti J-20低 温 离 心 机（ 德 国Heraeus Inc），鼠抗人Aurora-A单克隆抗体（Santa Crus Biotechnology，Inc），Taq DNA聚 合 酶（ 日 本Takara公司），RNA酶抑制剂（美国Promega公司），ABC免疫组化检测试剂盒（华美生物工程公司）。

1.4qPCR测定mRNA 以提取的RNA进行扩增。其引物序列及目的片段的长度见表1。qPCR程序：样品裂解提取RNA，反转录制备cDNA，设定程序为两步法Real-Time PCR，预变性95℃，1min；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，20s；共进行40个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。选择明亮条带的产物进行正反向测序，电压设定120V，电流60mA，然后在自动凝胶成像系统上成像观察扩增结果。

表1　Aurora -A引物序列

1.5组织标本获取 用PANC-1和PANC-1/R2 分别通过皮下移植再原位移植构建胰腺癌动物模型，每组各20例，所有裸鼠每天检查、每周称重，于制模后第35d称重后处死。收集肿瘤病灶及淋巴结和内脏等标本组织。胰腺肿瘤组织在拭干表面水分后立即在电子称上称重并记录，游标卡尺测量肿瘤体积并记录。标本取下后作好标记，用预冷的生理盐水冲洗，并将肿瘤组织1块（用于免疫组化染色），并立即置入液氮罐中，后转入-80℃冰箱保存。其余肿瘤组织石蜡包埋切片HE染色。所有肿瘤组织均得到病理切片证实。

1.6免疫组化 免疫组织化学染色程序按试剂盒说明书进行，磷酸缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。Aurora-A蛋白免疫组化阳性表达定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒。本实验设阳性和阴性对照黄色颗粒。在光学显微镜下观察全片，对切片染色阳性情况进行评估，结果判定参照文献进行［3］。随机选取5个高倍视野，依据阳性细胞数量、百分率，表达强度分为四级：0级：无明显阳性反应细胞。Ⅰ级：阳性细胞＜25%、弱染色。Ⅱ级：阳性细胞在25%～75%之间。Ⅲ级：阳性细胞＞75%、强染色。0～Ⅰ级为阴性表达；Ⅱ～Ⅲ级为阳性表达。在显微镜下取不同放大倍数，拍照、保存结果。

1.7统计学方法 采用SPSS 14.0 统计软件。两样本均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 PANC-1组和PANC-1/R2组裸鼠的体重、肿瘤质量及转移率比较 见表2。

表2　PANC-1组和PANC-1/R2组裸鼠的体重、肿瘤质量及转移率比较（x±s）

2.2Aurora-A mRNA在 PANC-1组 和 PANC-1/ R2组中的表达 通过qPCR技术检测PANC-1和PANC-1/R2细胞株Aurora-A mRNA的表达情况，PANC-1组Aurora-A mRNA表达是（1.002±0.040）；PANC-1/R2组 Aurora-A mRNA是（1.845±0.069），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.3Aurora-A蛋白在PANC-1和PANC-1/R2组中阳性表达率比较 见表3、图2。

图1　两组细胞株Aurora-A mRNA的表达情况

表3　Aurora-A蛋白在PANC-1和PANC-1/R2组中阳性表达率比较［n（%）］

图2　Aurora-A胰腺癌阳性表达免疫组化

3　讨论

Aurora-A激酶是新近发现的调节中心体、微管功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在中心体成熟、纺锤体形成、染色体分离，即有丝分裂的正常进行中发挥重要的作用。目前，Aurora-A已被认为是一个与多种恶性肿瘤发生相关的癌基因。当前众多研究发现，Aurora-A在乳腺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等多种人类恶性肿瘤中高表达［5，6］。其表达水平与肿瘤的组织学分级、临床分期和患者预后具有相关性［7］。抑制Aurora-A激酶活性，可有效阻碍细胞的生长、增殖，并引起肿瘤细胞的凋亡［8］。当肿瘤细胞面对化疗药物的作用下出现DNA的损伤，而Aurora-A恰能对损伤的DNA进行修复，从而出现耐药。研究表明Aurora-A的高表达是产生肿瘤耐药的重要因素［9，10］。既往的研究着重于Aurora-A的表达与肿瘤及预后的关系，如Sakakura 等［11］报道，存在Aurora-A 基因扩增的原发性胃癌患者比未发现Auror a-A 基因扩增的患者预后更差。Warner 等［12］比较Aurora-A和Aurora-B 作为胰腺癌抗癌治疗的分子靶点，发现以Aurora-A 为靶点治疗可能在有丝分裂停滞和快速诱导程序性死亡方面，优于针对Aurora-B 为靶点的治疗。但缺乏通过构建耐药细胞株及耐药动物模型，以此作为研究平台评估Aurora-A表达与胰腺癌吉西他滨耐药的关系，并评价其与转移方式和转移率的关系。

PANC-1/R2细胞株是通过体外培养体内诱导方式，循环两轮后获得的耐药细胞株。用此细胞株和PANC-1细胞株构建胰腺癌模型，发现两者的生物学行为并不相同，PANC-1/R2恶性程度更高，表现在该组的瘤体重量更重，而裸鼠的体重相对轻，但胰腺癌的转移率明显升高，达50%，而PANC-1为36.8%。提示耐药的胰腺癌细胞的生物学恶性程度也相应提高。本资料结果表明，蛋白水平和基因水平均证实Aurora-A的表达与胰腺癌吉西他滨的耐药有关，具体为耐药细胞Aurora-A高表达，敏感细胞Aurora-A低表达，证实Aurora-A的表达与胰腺癌吉西他滨耐药有关，这与文献报道相符合。Aurora-A如何参与肿瘤的发生和耐药产生，目前有较多观点。认为Aurora-A过表达能够在Cdc20-BubR1 相互作用的水平上，通过干扰有丝分裂检测点复合物的恰当组装导致基因不稳定和肿瘤生长［1］。目前多药耐药的机制尚不明确，宏观上讲与肿瘤细胞的自我吞噬增强自身抵抗力以及减少凋亡有关。Aurora-A参与自噬调节的研究不多，但已报道的研究结果表明Aurora-A可以通过自噬的途径诱导肿瘤的耐药。Zou［13］的研究发现Aurora-A阳性表达的乳腺肿瘤组织中自噬相关蛋白SQSTM1呈现高表达，该研究通过小分子VX-680或sRNA干扰抑制Aurora-A的表达，发现微管相关蛋白1轻链3-II（LC3-II）和自噬体明显增加，而SQSTM1明显降低；而过度表达Aurora-A则抑制自噬。Aurora-A通过负向调节自噬的途径发挥诱导乳腺细胞自噬性的凋亡。该研究结果提示Aurora-A的高表达抑制自噬，低表达诱导自噬产生对药物的耐药，这与本研究结果不符合，推测自噬在耐药产生中并非主导作用。而Hamidi［14］研究表明Nupr1通过调节Aurora-A激酶对抗因缺氧及糖饥饿引起的自噬性的细胞程序性死亡，提示非DNA损伤性的抗癌药物耐药可能与Aurora-A有关。p53、PP1、Cyclin B1-cdc2、BRCA1、RasGA P、Survivin、c-myc与Aurora-A的相互作用是导致胰腺癌发生耐药的可能原因。可见，Aurora-A参与肿瘤形成及多药耐药的机制研究较多，机制复杂，但目前与自噬相关的较少，而其作用逐步得到认识，具有广阔的研究前景。

1Huynh AS， Abrahams DF， Torres MS，et al.Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells.PLoS One，2011，6（5）：e20330.

2Menke C， Goncharov T， Qamar L，et al. TRAIL Receptor Signaling Regulation of Chemosensitivity In Vivo but Not In Vitro. PLoS One，2011， 6（1）：e14527.

3El-Sheikh A， Fan R， Birks D， et al. Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma Cell Lines. Pediatr Blood Cancer，2010，55：35～41.

4Kumano M， Miyake H， Terakawa T， et al. Suppressed tumour growth and enhanced chemosensitivity by RNA interference targeting Aurora-A in the PC3 human prostate cancer model. Br J Uri Int. 2009， 121～127.

5Wang X X， Liu R， Jin S Q， et al. Over expression of Aurora-A kinase promotes tumor cell proliferation and inhibits apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cellline. Cell Res，2006， 16（4） ： 356～366.

6Tanaka E， Hashimoto Y， Ito T， et al. The clinical significance of Aurora-A/STK15/BTAK expression in human esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res， 2005， 11（5）： 1827～ 1834.

7Reznikoff CA， Belair CD， Yeager TR， et al. A molecular g enetic model of human bladder cancer pathogenesis .Semin Oncol， 1996， 23（5）：571～584.

8Borges K S， Castro-Gamero A M， Moreno D A，et al. Inhibition of Aurora kinases enhances chemosensitivity to temozolomide and causes radiosensitization in glioblastoma Cells. J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（3）：405～414.

9Tanaka E， Hashimoto Y， Ito T， et al. The Suppression of Aurora-A/ STK15/BTAK Expression Enhances Chemosensitivity to Docetaxel in Human Esophageal Squamous Cell Carcinoma. Clin Cancer Res，2007，13（4）：1331～1340.

10El-Sheikh A， Fan R， Birks D， et al. Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma Cell Lines. Pediatr Blood Cancer，2010，55（1）：35～41.

11Sakaku ra C， H agiw ara A， Yas uoka R， et al. Tumou r-amplif iedkinaseBTAK is amplified and overex pressed in gastric cancers with possible involvement in aneu ploid formati on. Br J Cancer， 2001，84（6）： 824～831.

12Warner S L， Munoz R M， Stafford P， et al. Comparing Aurora-A and Aurora- B as molecular target s for growth in hibition of pancreatic cancer cells. Mol Cancer Ther， 2006， 5 （10） ：2450～2458.

13Zou Z， Yuan Z， Zhang Q， et al. Aurora kinase A inhibition-induced autophagy triggers drug resistance in breast cancer cells. Autophagy. 2012，8（12）：1798～1810.

14Hamidi T， Cano CE， Grasso D， et al. Nupr1-aurora kinase A pathway provides protection against metabolic stress-mediated autophagicassociated cell death. Clin Cancer Res. 2012，18（19）：5234～5246.

Objective To assess the relationship of Aurora-A expression with gemcitabine-resistance of pancreatic cancer. Methods The expression of Aurora-A mRNA of PANC-1 and PANC-1/R2 cells were tested by qPCR technique. The animal models of pancreatic cancer were estblised by PANC-1 and PANC-1/R2 cells. After 35days，mice were killed，and the tumor tissues were collected. The Aurora-A protein expression of the two groups were deteched by Immunohistochemistry. Results In the PANC-1 group，the metastasis of tumor on the fi ve weeks was 36.8% （7/19），the mean weight of tumor tissues was 0.453±0.110 g，and weight of mice was 23.2±1.41 g. While the metastasis of tumor on the fi ve weeks was 50%（9/18），the mean weight of tumor tissues was 0.564±0.203g，and weight of mice was 22.91±1.13g in PANC-1/R2 group. The metastatic rate and weight of tumor were with signifi cant differences （P＜0.05）. The expression of Aurora-A mRNA of PANC-1 cells was 1.002±0.040；while it was 1.845±0.069 in PANC-1/R2，it was signifi cant difference between the two groups （P＜0.05）. A 15 of 18 cases positive expression of Aurora-A protein were detected in PANC-1/R2 group，while it was 11 of 19 cases in PANC-1 group. The signifi cant difference was found between the two groups（P＜0.05）. Conclusions High expression of Aurora-A gene is associated with gemcitabine- resistance of pancreatic cancer cell lines. PANC-1/R2 cell was successful as a cell model of gemcitabine-resistance of pancreatic cancer.

Aurora-A kinase Pancreatic carcinoma Multiple drug resistance Gemcitabine

浙江省医药卫生科技计划（2012KYB018）；浙江省中医药优秀青年人才基金（2013ZQ022）

321013 浙江省金华文荣医院普外科（何永礼 施福田）321061浙江省金华市人民医院普外科（严秋亮）310009 浙江大学医学院附属第二医院外科（朱锦辉）310011浙江省消防总队医院（王欣）