肌红蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及临床价值

苏丽丽　潘钦石★　王瑜敏　黄卡特　丁鸿燕　张文辉

肌红蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及临床价值

苏丽丽潘钦石★王瑜敏黄卡特丁鸿燕张文辉

目的 探讨肌红蛋白（Mb）mRNA在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达情况及临床价值。方法 NSCLC患者癌组织标本57例，同时收集其对应的癌旁组织。采用实时荧光定量PCR检测Mb mRNA的方法，以GAPDH为内参基因，通过计算2-△△CT，判断NSCLC癌组织与癌旁组织的mRNA表达差异。同时分析Mb mRNA表达水平与NSCLC病理类型、组织分化、临床分期、淋巴结转移等的相关性。结果 成功建立实时荧光定量PCR检测Mb mRNA的方法；NSCLC癌组织Mb mRNA表达水平明显高于其癌旁组织（P＜0.05）。Mb mRNA表达水平与病理类型、肿瘤临床分期、淋巴结转移、组织分化程度、是否吸烟等差异无统计学意义（P＞0.05）；而在不同性别中差异有统计学意义，女性Mb mRNA表达水平高于男性（P＜0.05）。肿瘤体积越大，Mb mRNA表达水平越高。结论 Mb mRNA在NSCLC中出现明显上调，可能在NSCLC的发病机制起重要作用。

非小细胞肺癌 缺氧 肌红蛋白 mRNA

近年来，肺癌已取代肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因，占全部恶性肿瘤死亡的22.7%，且发病率和病死率仍在迅速上升［1］。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的最常见类型，占所有肺癌的80%，临床以腺癌和鳞癌多见。目前对于NSCLC治疗效果仍不理想，5年生存率仅10%～15%［2，3］。本文探讨肌红蛋白（Mb）mRNA在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达情况及临床价值。

1　临床资料

1.1一般资料 收集2013年7月至 2014年2月本院NSCLC患者的癌组织及癌旁组织标本57例，其中男28例，女29例；年龄40～79岁，平均年龄（62.5±9.3）岁。腺癌 41例、鳞癌11例、腺鳞癌5例。Ia期12例、Ib期28例、IIa 7例、IIb 2例、IIIa 8例。低分化11例、中低分化7例、中分化17例、高中分化9例、高分化13例。淋巴结转移14例、无淋巴结转移43例。临床分期按照2002年国际抗癌联盟公布的修订后的肺癌国际分期标准。经病理学或影像学检查证实是否有淋巴结转移或远处转移。以上病例均经X线胸片、胸部CT、痰脱落细胞学、纤维支气管镜活组织检查或胸腔积液脱落细胞学检查确诊。

1.2方法 选择本院心胸外科手术切除并经病理确诊且临床资料完整的肺癌组织标本，同时取癌旁组织（距病变组织＞5cm取材，均经病理证实为正常肺组织）；置-196℃液氮中保存。并收集患者的临床资料包括性别、年龄、病理类型、临床分期、分化程度、淋巴结转移、吸烟、肿瘤大小等。（1）肺癌组织RNA的提取 Trizol 试剂盒一步法分离提取总RNA按照Invitrogen公司提供的Trizol试剂盒说明书步骤进行，所用EP管、tip头、去离子水均经无RNase化处理。具体步骤：①肺癌组织（肺癌组织标本和癌旁组织标本，分别机械剪碎并碾磨）：PBS洗涤2遍，加抽提液Trizol 1ml（用枪吸混匀），转移至无RNase的Eppendorf管中，室温放置5min。②RNA分离：加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温下静置5min，然后4℃、10000r/min，离心15min。③RNA沉淀：将上层水相转移至经DEPC水处理过的聚丙烯管中，按等体积加入异丙醇，混匀后室温下静置10min，然后4℃、10000 r/min，离心10min。④RNA漂洗：弃上清液，加75%乙醇（用DEPC水溶解）1ml，充分振荡混匀，然后4℃、6500 r/min，离心5min。⑤RNA再溶：室温下干燥RNA沉淀物5min，加20μl DEPC水吹打溶解。⑥总RNA 浓度分析和纯度鉴定：将2μl RNA 溶解于98μl DEPC 水中，用紫外分光光度计测定其在波长260 nm 和280 nm 处吸光度值（OD260 和OD280），OD260/OD280 比值在1.6～2.0，表示RNA 样品纯净。计算样品中的RNA 浓度：RNA（μg/ml） =OD260 值×40 μg/ml×稀释倍数。以1.2%琼脂糖凝胶电泳检查RNA 的完整性，剩余RNA 置于-70℃冰箱内保存。（2）逆转录：将提取的总RNA取一部分立即进行逆转录。操作参考Takara公司提供的说明书。同时对cDNA的鉴定，合成的cDNA 经GAPDH 引物PCR 扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳进行观察。（3） 实时荧光定量PCR反应 设计Mb mRNA、GAPDH基因引物。最佳PCR条件的优化：分别对引物，模板，SYBGREEN I PCRmix液进行优化。根据3.2的PCR反应条件，将上述体系各试剂加样离心混匀后置于ABI7000全自动荧光PCR仪。④根据2-△△Ct方法计算结果。

1.3统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。Shapiro-Wilk test评估数据是否呈正态分布；计量资料呈非正态分布，以M（Q1，Q3）表示。多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Pearson关系分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Mb mRNA熔解曲线 Mb mRNA的引物特异性较好。见图1。

图1　Mb mRNA熔解曲线

2.2NSCLC患者Mb mRNA相对表达量比较 见表1。

表1　NSCLC患者Mb mRNA的相对表达量的比较

2.3NSCLC癌组织及癌旁组织Mb mRNA的表达情况 NSCLC癌组织Mb mRNA相对表达水平为3.355（1.28，12.181），明显高于其癌旁组织（P=0.000）。见图2。

2.4不同病理类型Mb mRNA的表达情况 不同病理类型癌组织的Mb mRNA的表达水平差异无统计学意义（P=0.145）。

2.5Mb mRNA的 表 达情况与淋巴结转移、临床分期的相关分析 发生淋巴结转移NSCLC癌组织Mb mRNA表达水平与未发生淋巴结转移组的差异无统计学意义（P=0.150）。不同临床分期的Mb mRNA表达水平差异亦无统计学意义（P=0.940）。

2.6Mb mRNA表达情况与组织分化程度、吸烟、性别的关系分析 不同的组织分化程度（P=0.273）、有无吸烟（P=0.194），Mb mRNA的表达差异无统计学意义；但不同性别Mb mRNA的表达差异有统计学意义（P=0.024）。

2.7Mb mRNA表达情况与肿瘤组织体积大小的Pearson关系分析 肿瘤组织体积越大，Mb mRNA表达水平越高，两者具有明显正相关性（P=0.002）。

图2　NSCLC癌组织及癌旁组织Mb mRNA的相对表达量比较

3　讨论

肌红蛋白（Mb）是一种广泛存在于人及哺乳动物心肌和骨骼肌细胞内的蛋白质，具有储存和运输氧的功能［4］。Mb参与细胞氧代谢，作为氧短期和长期贮存方式，便于氧从细胞膜扩散到线粒体［5］。

缺氧是实体肿瘤的共同特征。一方面，无规律生长超过血管所有需氧的量［6］。另一方面，较正常组织而言，肿瘤血管功能常受损，因为其结构和生物具有异常，包括弯曲，泄漏，缺乏周细胞，分布不均匀和任意互连等［7］。因此，肿瘤病灶也包括局部区域，无论附近有无血管存在，通常会出现急性或慢性缺氧情况［8］。作者推测如果癌细胞表达类似异常功能氧转运酶，那么对整个肿瘤而言，血管就会捕获更多氧气，受益于更均化氧化，以及在缺氧周期少受损伤。有关Mb mRNA在肿瘤中的作用有文献报道，Mb免疫反应常被用作肉瘤和横纹肌肉瘤要确认表型的标记［9～11］，已被证实在上皮癌中Mb mRNA表达上调［12］。

本资料结果显示NSCLC癌组织Mb mRNA的表达量明显高于正常癌旁组织，表明其在肿瘤的发生发展过程中起着一定的作用，可能参与肿瘤的缺氧过程，这与国外学者Oleksiewicz U等［13］报道基本一致。进一步分析表明其表达量与病理类型、临床分期、淋巴结转移及是否吸烟等无关；但男女患者的表达量却有差异，女性高于男性，这可能与特定性别患者体内存在的基础值不同或与其基础疾病有关。另外，Mb mRNA表达水平与肿瘤体积大小密切关联，肿瘤体积越大，Mb mRNA表达水平越高，表明肿瘤体积越大，生长比较迅速，更容易出现缺氧，这时Mb mRNA水平升高，运输更多的氧来缓解。

综上所述，Mb mRNA在NSCLC中出现明显上调，可能在NSCLC的发病机制乃至预后起重要作用。

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4Brunori M， Bourgeois D， Vallone B， et al. The structural dynamics of myoglobin. J Struct Biol， 2004，147（3）：223～234.

5Wittenberg JB， Wittenberg BA. Myoglobin function reassessed. J Exp Biol，2003，206：2011～2020.

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7Jain， R.K.Normalization of tumor vasculature： an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science，2005，307（5706）：58～62.

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12Flonta S， Arena S， Pisacane A， et al. Expression and functional regulation of myoglobin in epithelial cancers. Am J Pathol，2009，175（1）： 201～206.

13Oleksiewicz U， Daskoulidou N， Liloglou T，et al.Neuroglobin and myoglobin in non-small cell lung cancer： Expression， regulation and prognosis.Lung Cancer， 2011，74（3）：411～418.

Objective To analyze the expression and clinical value of Myoglobin（Mb） mRNA in non-small cell lung cancer （NSCLC）tissue. Methods We collected 57 cases of NSCLC tissue specimens and corresponding adjacent tissues in the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University from July 2013 to February 2014. We established the real-time quantitative PCR method to detect Mb mRNA，GAPDH as reference gene，with calculating the 2-△△CT，to determine different expression of adjacent Mb NSCLC and cancer tissue. Otherwise，we analyzed the correlation of tissue Mb mRNA with NSCLC to histological type，histological grade，clinical stage，lymph node metastasis and other clinical data. Results We successfully established real-time PCR method for detecting Mb mRNA；Mb mRNA expression levels of NSCLC tissues were signifi cantly higher than its adjacent tissues （P＜0.05）. The expression of Mb mRNA was no relative to clinical stage，lymph node metastasis， histological type，histological grade，and smoking（P＞0.05）. The expression levels of Mb mRNA was signifi cant in different gender，the expression levels of women higher than men（P＜0.05）. Tumor volume was higher，Mb mRNA expressed higher. Conclusion The expression of Mb signifi cantly increases in NSCLC and it may play an important role in the pathogenesis of NSCLC.

Non-small cell lung cancer （NSCLC） Hypoxia Myoglobin （Mb） mRNA

浙江省温州市科技局项目资助（Y20110041）

325000浙江省温州市中心血站（苏丽丽）325000 温州医科大学附属第一医院（潘钦石 王瑜敏黄卡特 丁鸿燕 张文辉）