芹菜素对大鼠脑缺血再灌注后的转化生长因子-β1表达的影响*

王果　陈翔

（1.浙江省杭州市第一人民医院，浙江杭州310000；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院康复中心，浙江温州325000）

·研究报告·

芹菜素对大鼠脑缺血再灌注后的转化生长因子-β1表达的影响*

王果1陈翔2△

（1.浙江省杭州市第一人民医院，浙江杭州310000；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院康复中心，浙江温州325000）

目的探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）在大鼠脑缺血再灌注后不同时间的表达变化及芹菜素对其表达的影响。方法采用改良线栓法建立大鼠脑缺血再灌注后不同时间损伤模型。随机分为假手术组、模型组、芹菜素组和地塞米松组，各手术组按再灌注时间不同又分为再灌注6 h组、24 h组、72 h组、7 d组4个亚组。各组麻醉清醒后均给予神经行为学评分，每组1只，大鼠予2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色观察脑梗死灶，6只免疫组化法测定转化生长因子-β1的表达。结果在芹菜素72 h组神经行为学评分低于模型72 h组（P＜0.05）；各手术组均出现白色梗死灶；缺血再灌注后TGF-β1表达增加，于24、72 h达高峰，芹菜素组能显著提高TGF-β1的表达，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。结论芹菜素可增加脑缺血再灌注后TGF-β1的表达，提示芹菜素可能通过TGF-β1促进脑组织损伤的修复，达到神经损伤的保护作用。

芹菜素脑缺血再灌注2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色转化生长因子-β1

脑卒中严重危害人类的健康，卒中时的脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程，造成神经功能的不同程度的损害［1］。对其损伤及修复治疗过程一直是研究的热点。脑缺血再灌注时诱导产生的转化生长因子-β1（TGF-β1）表达增加［2］。TGF-β1是具有多重调节功能的细胞转化生长因子，其生物学作用复杂多样，并依据不同的细胞类型和病理环境发生变化。传统观点认为TGF-β1可促进神经元生存，促进其分化，增加神经元的轴突数目，并具有加速神经组织修复的作用［3］。芹菜素（APG）是一种来源广泛的植物黄酮，具有抗氧化、抗炎、神经保护、免疫调节、抗肿瘤等多种活性［4］。课题组前期实验中发现芹菜素可通过抑制NF-κB的活化、减少iNOS的产生及缺血半暗区小胶质细胞的过度活化［5］，而抑制缺血再灌注继发的炎症反应。本实验在前期研究基础上，进一步探讨大鼠脑缺血再灌注后TGF-β1的表达，及芹菜素是否能通过调节其表达进一步参与再灌注后神经细胞的损伤和修复。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠共91只，体质量（250±20）g，由温州医学院动物实验中心提供，合格证号：SYXK（浙）2005-0061。

1.2药物与试剂芹菜素（陕西慧科植物开发有限公司，批号：HK20081218）、地塞米松磷酸钠注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：0901055），2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色购自sigma公司（批号：000298964），TGF-β1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司（批号：BA0290）；即用型SABC快速免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司（批号：SA1028）。

1.3仪器德国LEICA公司CM1900冰冻切片机；日本Olympus公司BX41光学显微镜；美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus 6.0（IPP6.0）彩色医学图像分析系统；尼龙栓线购自北京沙东生物技术有限公司（产品号：2636-A3）。

1.4分组与造模将大鼠随机分为模型组、芹菜素组和地塞米松组，各28只，再按按再灌注时间分为再灌注6 h组、24 h组、72 h组、7 d组4个亚组，每个亚组各7只，另取7只为假手术组。参照Belayev［6］报道的线栓法进行改良，建立急性大脑中动脉栓塞和再灌注模型。缺血2 h后将栓线退回到颈内、外动脉分叉处实现再灌注。假手术组栓线只插到颈内、外动脉的分叉处。

1.5给药方法各组于造模再灌注同时及其后的每隔24 h分别腹腔注射给药，芹菜素组剂量为25 mg/kg（0.8 mL/100 g）、地塞米松组剂量为5 mg/kg（0.8 mL/ 100 g），假手术组和模型组给予等体积生理盐水。

1.6标本采集与检测

1.6.1神经行为学评分阻断血流1 h后参照Zea Longa［7］5分制评分标准进行神经行为学评分：0分为无神经缺损症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为行走时向偏瘫侧转圈；3分为行走时向偏瘫侧倾倒；4分为不能自发行走，意识受到抑制；5分为死亡。

1.6.2脑组织切片2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色各组随机取1只观察至再灌注后24 h，用10%水合氯醛麻醉后，经左心室迅速灌注冰生理盐水150 mL，快速断头取脑，以2 mm间距冠状切成6片，浸在2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑缓冲液中，置37℃的水浴箱中避光染色30 min，再在4%的多聚甲醛中固定过夜，数码相机拍照观察。

1.6.3免疫组织化学观察TGF-β1的表达各亚组大鼠6只观察至规定的时间后，灌注固定后取脑，冠状切取前囟前1.0 mm至前囟后2.0 mm的左半球脑组织，置4%多聚甲醛中后固定2 h，再置30%蔗糖中4℃冰箱过夜至组织沉底，OCT包埋液氮速冻后移入-80℃冰箱保存备用；冰冻切片机冠状连续切片，8 μm厚，每隔10张取1张，每只大鼠取5张切片。检测方法按试剂盒说明书进行。封片后，自然晾干，并尽快观察与摄片。图片放大倍数表示物镜倍数乘目镜放大倍数。每只大鼠取免疫组化切片5张，置于高倍镜下（400倍），每张切片于脑缺血梗死区周围随机选取阳性表达区域5个非重叠视野摄片后，用美国IPP6.0分析软件进行图像分析，测量阳性细胞的OD值。

1.7统计学处理采用SPSS17.0统计软件处理。所有数据进行正态性检验，计量资料以（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett’T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠缺血再灌注后神经行为学评分比较见表1。模型组在脑缺血再灌注后7 d神经行为学评分较再灌注6 h减小（P＜0.05）；芹菜素组在脑缺血再灌注后7 d神经行为学评分较再灌注6 h、再灌注24 h减小（P＜0.05），在再灌注72 h神经行为学评分低于模型再灌注72 h组（P＜0.05）；地塞米松组在再灌注7 d神经行为学评分较本组再灌注6 h、24 h有减小（P＜0.05）；余各相应时间点间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　各组大鼠缺血再灌注后不同时间点神经行为学评分比较（分，±s）

表1　各组大鼠缺血再灌注后不同时间点神经行为学评分比较（分，±s）

与模型组同时间比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与本组6 h时比较，■P＜0.05；与本组24 h组比较，◆P＜0.05。下同。

组别n 再灌注6 h再灌注24 h再灌注72 h再灌注7 d模型组7芹菜素组7 2.3452±0.8175 2.2031±0.8128 1.9892±0.72891.2823±0.6134■1.9889±0.6456 1.7202±0.6548 1.0223±0.5834▲0.7039±0.5846■◆地塞米松组72.2019±0.8089 1.9801±0.7376 1.1871±0.69320.7298±0.5494■◆

2.2各组大鼠脑组织梗死灶比较见图1。假手术组脑片均红染，未见白色梗死灶形成；模型24 h组可见尾壳核和额颞顶叶皮层白色梗死灶的融合；地塞米松24 h组及芹菜素24 h组的梗死灶较相应时间的模型组均有不同程度的减小，主要表现在皮层。

图1　各组脑组织切片2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色图

2.3各组脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织TGF-β1的表达见表2。正常脑组织TGF-β1呈极低表达。模型组、芹菜素组和地塞米松组各时间点TGF-β1的表达明显增加，与假手术组差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组、芹菜素组、地塞米松组TGF-β1表达在24 h、72 h时达高峰（P＜0.01），各组24 h和72 h组之间比较无明显差异，7 d仍有大量表达。芹菜素组和地塞米松组较同期模型组表达均有明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。芹菜素组和地塞米松组相对应时间组之间表达量无明显差异。

表2　芹菜素和地塞米松对大鼠脑缺血再灌注后TGF-β1表达的影响（OD值，±s）

表2　芹菜素和地塞米松对大鼠脑缺血再灌注后TGF-β1表达的影响（OD值，±s）

与假手术组比较，★P＜0.01。

组别n模型组6芹菜素组6再灌注6h再灌注24h再灌注72h再灌注7d 0.2728±0.0325★0.3761±0.0327★0.3570±0.0242★◆◆0.3269±0.0243★0.3098±0.0181★▲▲0.4444±0.0206★▲▲0.4256±0.0175★▲▲0.3581±0.0181★▲▲地塞米松组60.3292±0.0170★▲▲0.4326±0.0161★▲▲0.4211±0.0277★▲▲0.3551±0.0224★▲假手术组60.1287±0.0223

3　讨论

本研究结构显示，脑缺血再灌注时大鼠均出现不同程度神经行为学评分异常，但随着再灌注时间的延长，大鼠神经功能逐渐恢复。芹菜素组和地塞米松组神经行为学评分与模型组比较各时间点均有下降的趋势，其中芹菜素组72 h较同时间点各组相比差异有统计学意义。国内外学者多普遍采用的TTC作为梗死区域的检测标记［8］，其具有快速、灵敏、可靠、直观等优点。本实验结果显示各组均出现白色梗死灶，且脑梗死体积有自然缩小的趋势。芹菜素组在各时间点梗死体积均较模型组有减小，与前期实验结果［9］相符。地塞米松组在各时间点梗死体积均较模型组有减小，亦与Bertorelli等［10］实验结果相符。

缺血性脑损伤的动物实验研究及临床研究发现脑缺血后有多种细胞因子、趋化因子、黏附分子和各种生长因子的表达［11］，而缺血周围区的神经细胞转归则受到多种因素的影响。在中枢神经系统，星形胶质细胞、小胶质、少突胶质细胞均可产生TGF-β1。TGF-β1是一类具有复杂功能的细胞因子，作用涉及调节细胞生长、增殖、分化，参与炎症反应和组织修复，体内很多正常组织或细胞都能合成释放这种因子［12］，可抑制神经元的变性和凋亡［13］，修复受损的脑组织［14］。TGF-β1具有多种生物学效应，参与体内多种病理和生理过程，如免疫炎症反应、细胞生长和活化、肿瘤的发生及进展、神经细胞的凋亡、血管的发生、超氧离子的产生等［15］。TGF-β1能通过调节纤连蛋白的合成促进胚胎干细胞的增殖［16］，也能通过参与调节表皮生长因子受体基因的活化而影响软骨细胞的形成［17］，亦能参与调控轴突的生长［3］和神经干细胞的增殖和分化［18］。在缺血性脑损伤中，TGF-β1有抗氧化、阻止细胞凋亡、调节生理反应、调节小胶质细胞和星形胶质细胞反应的多种作用，它可通过抑制缺血早期中枢神经系统的炎症反应，从而减轻脑水肿、减小梗死面积、促进微血管增生［2］，对组织的修复发挥重要作用。

图2　各组缺血侧皮层TGF-β1胞浆阳性表达（DAB，400倍）

芹菜素组和地塞米松组各时间点TGF-β1的表达较同期模型组表达均有增加，以24 h、72 h组表达增加最为明显（P＜0.01），7 d仍有大量表达。芹菜素组与地塞米松组相比差异无统计学意义。芹菜素是一种黄酮类化合物，能抑制大鼠脑缺血再灌注继发的炎症反应，降低脑毛细血管通透性和脑水肿，能通过TGF-β参与调节毛发的生长［19］。

综上，脑缺血再灌注后大鼠出现神经行为功能的改变伴有不同程度的脑梗死，TGF-β1在再灌注后表达明显增加，而芹菜素在一定程度上改善大鼠神经功能的缺损，并能增强脑缺血后TGF-β1表达，从而达到促进脑组织损伤的修复，达到神经损伤的保护作用。

［1］Jickling GC，Liu D，Stamova，et al.Hemorrhagic transformation after ischemic stroke in animals and humans［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2014，34（2）：185-199.

［2］Wang Y，Hu Z，Lu W.A modulator for Golgi structural stability after cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.See comment in PubMed Commons belowNeural Regen Res，2013，58（25）：1673-5374.

［3］Bain JM，Ziegler A，Yang Z，et al.TGF beta1stimulates the over-production of white matter astrocytes from precursors othe brain marrow in a rodent model of neonatal encephalopathy［J］.PLoS One，2010，5（3）：9567.

［4］朱荣鑫，张赛龙，金永生.黄酮类化合物抗肿瘤作用研究进展［J］.现代药物与临床，2010，25（1）：5-10.

［5］韩书珍，范海玲，陈翔.芹菜素对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠半暗区内小胶质细胞的影响［J］.中草药，2011，42（2）：312-317.

［6］Belayev L，Alonso OF，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture：Neurological and pathological evaluation of an improved model［J］.Stroke，1996，27：1616-1623.

［7］Zea Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［8］Goldust EJ，Paczynski RP，He YY，et al.Automated measurement of infact size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains［J］.Stroke，1996，27：1657-1662.

［9］刘婵，涂丰霞，陈翔.芹菜素对大鼠急性脑损伤的保护作用［J］.中草药，2009，40（10）：1598-1602.

［10］Bertorelli R，Aslarm M，Di Santo E，et al.MK801 and dexamethasone reduce both tumor necrosia factor levels and infarct volume after focal cerebral ischema in the brain［J］.Neurosci Lett，1998，246（1）：41-44.

［11］Berti R，Williams AJ，Moffett JR，et al.Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（9）：1068-1079.

［12］Raineteau，Schwab ME.Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury［J］.Nat Rev Neurosci，2001，（2）：263-273.

［13］李良勇，李家林，谢成娟，等.经鼻给予TGFβ1对癫痫持续状态大鼠海马神经元的保护作用［J］.中风与神经疾病杂志，2012，29（2）：109-112.

［14］Ma M，Ma Y.Intranasal delivery of transforming growth factor-beta1 in mice after stroke reduces infarct volume and increases neurogenesis in the subventricular zone［J］.BMC Neurosci，2008，9（10）：117.

［15］Vivien D，Ali C.Transforming growth factor-beta signalling in brain disorders［J］.Cytokine&Growth Factor Reviews，2006，17（1-2）：121-128.

［16］Kim Y，H J，Ryu M，et al.Fibronectin synthesis by high glucose level mediated proliferation of mouse embryonic stem cells：Involvement of ANGⅡand TGF-betal［J］.J Cell Physiol，2010，223（2）：397-407.

［17］Takeda H，Inoue H.Activation of epidermal growth factor receptor gene is involved in transforming growth factor-betamediated fibronectin expression in a chondrocyte progenitor cell line［J］.Int J Mol Med，2010，25（4）：593-600.

［18］Sun J，Zhou W.Ischemia induced neural stem cell proliferation and differentiation in neonatal rat involved vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-beta pathways［J］.Brain Dev，2010，32（3）：191-200.

［19］HuhS，LeeJ.Acell-basedsystemforscreeninghairgrowth-promotingagents［J］.ArchDermatolRes，2009，301（5）：381-385.

Effects of Apigenin on the Expression of Transforming Growth Factor-β1after Cerebral Ischemia-reper-fusion in Rats

WANG Guo，CHEN Xiang.Hangzhou First People′s Hospital，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 310000，China

Objective：To investigate the effects of apigenin（APG）on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）of focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods：Cerebral ischemia was induced by middle cerebra artery occlusion.The rats were randomly divided into four groups including Sham-operated，Mode，APG and Dexamethasone groups.All the operated groups were divided into different groups：reperfusion 6 h group，24 h group，72 h group and 7 d group.Neurological behavior was assessed with five score methods.After anesthesia awake，each group was given neurological behavior scores.One brain slice was observed by 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）stainning，and the expression of TGF-β1in another six brain slices were measured by immunohi stochemistry.Results：Neurological behavior scores of the rats in A72 h group was significant lower than those in ischemia M72 h group（P＜0.05）.Typical cortical infarct lesions in Mode group were found by TTC stainning.The expression of transforming growth factor-β1in normal brain tissue was in very low volume.The expression of transforming growth factor-β1were enhanced immediately after ischemia，and reached to peak at 24 hour and 72 hour after ischemia respectively，Apigenin could significantly increase the expressions of TGF-β1than ones at the corresponding time points in group M respectively（P＜0.05）.Conclusion：Apigenin can increase the expression of transforming growth factor-β1in transient focal cerebral ischemia and reperfusion in rats.They may repair ischemia brain tissue and improve neurological function recovery by transforming growth factor-β1.

Apigenin（APG）；Cerebral ischemia-reperfusion；2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）；Transforming growth factor-β1（TGF-β1）

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1546-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.015

2015-05-27）

浙江省温州市科技局国际合作项目（H20070034）

（电子邮箱：guoguo1109@163.com）