补肾活血化痰方对脑出血大鼠脑组织MMP-9表达及血清NSE的影响*

侯斌　张树泉　陈再林

（1.山东省泰安市中医医院，山东泰安271000；2.湖南省浏阳市中医医院，湖南浏阳410300）

·研究报告·

补肾活血化痰方对脑出血大鼠脑组织MMP-9表达及血清NSE的影响*

侯斌1张树泉1陈再林2

（1.山东省泰安市中医医院，山东泰安271000；2.湖南省浏阳市中医医院，湖南浏阳410300）

目的观察补肾活血化痰方对大鼠脑出血后脑组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达及血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）的影响。方法采用自体不凝血注入尾状核法制备脑出血模型。将大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾活血化痰方组，假手术组和模型组每日给予生理盐水灌胃，补肾活血化痰方组给予补肾活血化痰方煎剂。各组分别在脑出血术后24、48、72、120 h各个时点取血，留取脑组织标本。于各时点观测大鼠脑含水量，用免疫组化法检测大鼠脑组织MMP-9的表达水平，用酶联免疫吸附法测定血清中NSE的含量。结果补肾活血化痰方组各时点脑含水量明显低于模型组（P＜0．05），各时点脑组织MMP-9阳性表达较模型组明显减少（P＜0．01），血清NSE水平在48、72、120 h时较模型组显著降低（P＜0．01）。结论补肾活血化痰方能减轻脑水肿，减轻脑组织损伤，其作用可能和有效抑制脑出血大鼠脑组织MMP-9表达，降低血清NSE水平有关。

补肾活血化痰方脑出血基质金属蛋白酶-9神经元特异性烯醇化酶

脑出血后的脑水肿导致脑组织损伤和神经功能改变，颅内压增高严重时可以形成脑疝，这是脑出血高死亡率、高致残率的重要原因。近年研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）参与了血脑屏障的损害过程，其中MMP-9在血脑屏障的破坏过程中发挥重要作用，与脑出血及脑水肿关系密切［1］。神经元特异性烯醇化酶（NSE）是存在于神经元和神经内分泌细胞中的烯醇化酶，NSE升高标志神经元损伤。前期研究证实，补肾活血化痰方治疗急性期出血疗效肯定［2］，但机制尚不完全清楚。为了进一步探讨补肾活血化痰方治疗急性期脑出血的可能作用机制，笔者复制了急性期脑出血大鼠模型，就补肾活血化痰方对大鼠脑出血后脑组织MMP-9表达及血清NSE的影响进行研究，为其临床应用提供实验依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及分组选取健康、成年SD雄性大鼠96只，由山东省泰山医学院实验动物中心提供，体质量250～300 g，饲以标准饲料，自由饮水，20～25℃环境饲养。将其随机分为假手术组、模型组和补肾活血化痰方组，每组各32只。

1.2试剂及仪器MMP-9免疫组化检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），NSE试剂盒（上海拜力生物科技有限公司）；立体定位仪（华北生物仪器设备有限公司）；JY3002型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；MIAS医学图象分析系统（北航公司）。

1.3模型制备采用自体血注入尾状核法建立大鼠脑出血模型。大鼠术前8h禁食，4h禁水，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。将大鼠俯卧固定于立体定向仪上，门齿沟水平比耳间线低2.4 mm；头顶常规备皮，消毒，正中切口10 mm，沿矢状缝切开头皮，使前囟及冠状缝暴露，参照Rosenberg等［3］方法，于前囟前0.5mm，中线右侧旁开3 mm，用牙科钻钻一直径约3 mm的圆孔，深度达硬脑膜表面，不伤及脑组织。用1 mL注射器经右侧股动脉导管针抽取新鲜自体血100 μL，用微量注射泵将40 μL自体血经注血针缓慢注入到右侧尾状核内，注血完毕后，原位留针20 min，缓慢拔针，缝合皮肤，麻醉苏醒后出现神经功能缺损症状视为造模成功。假手术组仅用空针穿刺，但不注血，留针时间相同。

1.4给药方法补肾活血化痰方由制首乌、山茱萸、山药、麦冬、五味子、菖蒲、郁金、茯苓、三七、当归、川芎、丹参、益母草等组成，煎制、浓缩至每毫升含生药1.1 g（由山东省泰安市中医医院制剂室制备）。补肾活血化痰方组予中药液1.2 mL/100 g，模型组和假手术组予等量生理盐水。造模成功后3 h开始给药，每日灌胃1次，直至24、48、72、120 h各时点处死取材。

1.5标本采集及检测各组分别在脑出血术后24、48、72、120 h各个时点处死8只，留取标本。1）脑组织含水量。乙醚麻醉后，迅速断头取脑，距离针道前后1.5 mm冠状切取脑组织。取血肿边缘部分脑组织0.2 g左右，控制在5 min内完成，将标本放于100℃烘箱中烘干24 h至恒质量，再称干质量。按Billiot公式计算脑组织含水量：脑组织含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。以ng/mg表示脑组织湿质量。2）免疫组化SABC法检测脑组织MMP-9的表达水平。以针眼为中心取血肿周边脑组织约200 mg，常规脱水，石蜡切片60℃脱蜡过夜；二甲苯、梯度乙醇脱蜡，蒸馏水冲洗，3%双氧水37℃浸泡消除过氧化物酶，PBS冲洗，抗原热修复，滴加兔抗鼠MMP-9抗体，孵育2 h，冲洗，滴加生物素标记羊抗兔二抗，放置湿盒中，冲洗，孵育，DAB显色，洗涤，苏木素轻度复染，盐酸酒精分化中性树脂封片，显微镜观察，照片，留存。所有图像结果用计算机MIAS医学图像分析系统检测。切片于光镜下400倍放大，随机选取5个视野，测定MMP-9的阳性表达面积即目标面积与总统计场面积的比值即面密度（%）。阳性结果判断：细胞膜或胞浆着色呈棕黄色。3）血清NSE水平检测。在相应时间点末次给药30 min后，10%水合氯醛腹腔麻醉，用注射器经右侧股动脉导管针抽取新鲜血4 mL送实验室，应用酶联免疫吸附（ELISA）法对NSE水平进行测定。

1.6统计学处理采用SPSS18.0医学统计学软件处理，统计结果以（±s）表示，应用单因素方差分析，组间比较用SNK（Student-Newman-Keuls）法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠脑含水量的变化见表1。结果表明，假手术组个时间点脑含水量无显著差异（P＞0.05），表明假手术组大鼠未出现脑水肿。模型组和补肾活血化痰方组脑含水量在各时点均较假手术组增高，差异有统计学意义（P＜0.01），在72 h时达到高峰。补肾活血化痰方组与模型组相比较，脑含水含量明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明补肾活血化痰方针对脑出血后减少脑水肿含量作用显著。

表1　各组脑出血后不同时间点大鼠脑含水量比较（%，±s）

表1　各组脑出血后不同时间点大鼠脑含水量比较（%，±s）

与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别n 24 h48 h72 h120 h假手术组8模型组8 71.08±0.9771.32±1.5970.93±1.3270.21±1.21 77.12±1.09*79.39±2.01*81.71±1.09*75.57±1.69*补肾活血化痰方组874.11±1.16*△76.39±1.07*△77.68±0.92*△71.78±1.52*△

图1　MMP-9免疫组化染色（400倍）

2.2各组脑出血后大鼠脑组织MMP-9的表达比较见图1，表2。免疫组化染色结果显示，假手术组各时点见极少量MMP-9阳性表达；模型组、补肾活血化痰方组大鼠脑组织均可见染成棕黄色的MMP-9阳性表达信号，以胞质内为主，细胞间质也可见少量阳性表达，72 h时达高峰，染色强度加深，呈深棕色，120 h时表达回落，与假手术组相比，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；而与模型组比较，补肾活血化痰方组在各时点MMP-9阳性染色面积/总统计场面积，即面密度均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），至72 h时阳性细胞表达相差最为明显。

表2　各组脑出血后不同时间点大鼠脑组织MMP-9表达比较（%，±s）

表2　各组脑出血后不同时间点大鼠脑组织MMP-9表达比较（%，±s）

组别n 24 h48 h72 h120 h假手术组8模型组8 10.01±0.8710.97±1.0910.39±1.7710.26±1.35 68.12±2.59*78.39±1.51*85.27±3.16*58.19±2.01*补肾活血化痰方组845.72±3.19*△51.37±2.07*△60.19±2.95*△39.61±2.76*△

2.3各组大鼠各时点血清NSE水平比较见表3。结果显示，模型组和补肾活血化痰方组NSE水平在各时点均较假手术组增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。补肾活血化痰方组与模型组相比较，在24 h时血清NSE水平无明显统计学差异（P＞0.05），在48、72、120 h时明显低于模型组，差异有显著统计学意义（P＜0.01），结果表明补肾活血化痰方可降低血清NSE水平，针对脑出血后脑组织损伤的保护作用效果显著。

表3　各组脑出血后不同时间点血清NSE水平比较（μg/L，±s）

表3　各组脑出血后不同时间点血清NSE水平比较（μg/L，±s）

组别n 24 h48 h72 h120 h假手术组8模型组8 5.57±1.025.61±1.525.59±1.375.72±1.26 18.05±2.19*20.76±1.37*25.17±3.81*21.78±2.06*补肾活血化痰方组817.32±1.76*15.18±2.59*△16.49±1.78*△15.72±1.97*△

3　讨论

大量实验表明，脑出血造成的神经功能障碍与脑水肿及继发的脑组织损伤密切相关［4］。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明胶酶，与脑组织损伤关系最为密切［5］。MMP-9可降解ECM中的Ⅳ型胶原、V型胶原酶、纤黏蛋白、弹性蛋白、层黏素等，可破坏脑基底膜的完整性，导致血脑屏障破坏，为炎性细胞向脑组织浸润提供条件，进一步加重脑组织水肿及神经细胞损伤，是判断脑出血后血肿周围脑水肿严重程度及预后的重要指标。

NSE是一种参与糖酵解烯醇化酶的亚型，主要存在于大脑神经元和神经内分泌细胞，当神经细胞损伤或坏死后NSE从损伤的神经细胞漏出，通过血脑屏障进入脑脊液和血液。其对神经元损害极为敏感，是神经元损害的标志酶［6］，可对神经元损伤进行定量评价。有报道表明，脑出血患者的临床预后与血清NSE含量有直接而明显的关系［7］。因此监测NSE水平可以作为判断脑组织损伤以及预后的指标。

中医学认为，“脑为髓之海”“肾主骨生髓通脑”“瘀血不去新血不生”“痰瘀同源”。本院山东省名中医张树泉教授提出：络破血溢，痰瘀阻窍，髓海损伤是出血性中风的病理核心。脑组织损伤是肾虚的物质基础，血肿及其导致的缺血是血瘀的物质基础，循环障碍及脑组织水肿是痰阻的物质基础，其基本病机为肾虚血瘀痰阻。补肾活血化痰是出血性中风的基本治法［8］。补肾活血化痰方为治疗基本方，具有补肾活血、化痰利水之功。前期临床观察治疗急性期脑出血患者90例，能明显促进急性期血肿吸收，减轻脑组织水肿，改神经功能缺损NIHSS评分，改善预后［2］。

本研究显示，补肾活血化痰方组大鼠各时间点的脑组织含水量明显低于模型组，并且MMP-9的表达水平均较模型组明显下降，提示补肾活血化痰方抗脑出血后脑水肿的作用强，其机制可能与抑制MMP-9的表达从而减轻血脑屏障的破坏有关。同时，还观察了脑出血后对血清NSE水平的影响，结果显示补肾活血化痰方组大鼠48、72、120 h时的血清NSE水平明显低于模型组，提示该方能减轻急性期脑出血大鼠的神经细胞损伤，从而有利于抑制脑水肿的形成，保护神经功能。因此，补肾活血化痰方对中药治疗脑出血提供了理论和实验依据，但中药治疗脑出血的作用机制是多方面的，还需要进一步探讨。

［1］许宏伟，杨期东，刘晓英，等.MMP-2/9与脑出血后脑水肿的关系探讨［J］.中风与神经疾病杂志，2004，21（4）：295-297.

［2］张树泉，徐西元，侯斌，等.补肾活血化痰方治疗急性期脑出血临床研究［J］.中国中医急症，2012，21（4）：529-531.

［3］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801-807.

［4］Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al.Bahavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke，2002，33：2478-2484.

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［8］张树泉，张长平，陈马力.论补肾活血化痰是脑出血的重要治法［J］.中国中医急症，2012，21（3）：367-369.

The Effect of Bushen Huoxue Huatan Decoction on MMP-9 Expression and NSE in Serum in Rats with Intracerebral Hemorrhage

HOU Bin，ZHANG Shuquan，CHEN Zailin.Taian Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Taian 271000，China

Objective：To investigate the effect of Bushen Huoxue Huatan Decoction on MMP-9 expressions and NSE in serum in rats with intracerebral hemorrhage.Methods：Intracerebral hemorrhage（ICH）models were made with nonthrombogenic autologous blood injection method，and then the rats were randomly divided into 3 groups：the sham operation group，the model group and the Bushen Huoxue Huatan group.Rats in the sham operation group and the model group were given saline while rats in the Bushen Huoxue Huatan group were intragastrically administrated with Bushen Huoxue Huatan decotion every day.After cerebral hemorrhage 24 h，48 h，72 h and 120 h，cerebral water content was detected，and then brain was turned to detect the expression of MMP-9 with immunohistochemical method which was expressed around hematoma.NSE was detected with ELISA method.Results：Both cerebral water content and MMP-9 levels in Bushen Huoxue Huatan group at all the four time points were lower than those of the model group after ICH（P＜0.05，P＜0.01，respectively）.NSE concentration in serum was distinct lower than the model group at the time point of 48 h，72 h and 120 h after ICH（P＜0.01，respectively）.Conclusion：Bushen Huoxue Huatan Decoction may increase the expression of MMP-9 and reduce NSE concentration to protect the cerebral nerve of cerebral hemorrhage.

Bushen Huoxue Huatan Decoction；Intracerebral hemorrhage；MMP-9；NSE

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1543-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.014

2015-05-09）

山东省泰安市科技发展计划项目（20103063）