人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外分离培养及生物学特性比较

刘慧文

人骨髓和脐带来源间充质干细胞体外分离培养及生物学特性比较

刘慧文

目的 对人骨髓和脐带来源的间充质干细胞（MSC）体外分离培养，P3代细胞表面标志物及分泌细胞因子白细胞介素6（IL-6）的浓度进行比较。方法 流式细胞术检测免疫表型，Miliplex试剂盒检测IL-6的浓度。结果 两种细胞P3代均高表达CD90﹑CD105﹑CD44﹑CD73及HLA-ABC抗原，均不表达CD14﹑CD34﹑CD45等造血细胞相关抗原，UC-MSC不表达HLA-DR抗原，BM-MSC低表达HLA-DR抗原。骨髓间充质干细胞不同时间点分泌的IL-6浓度均高于脐带间充质干细胞，两者均逐步升高。结论 脐带间充质有更低的免疫原性，骨髓间充质干细胞在免疫调控方面更有优势。

骨髓间充质干细胞 脐带间充质干细胞 细胞免疫表型 白细胞介素6

间充质干细胞（MSC）是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，主要存在于骨髓基质中。由于其易提取扩增及低免疫原性，现已经广泛应用于临床细胞治疗［1，2］。较多研究比较分析不同来源的MSC的生物学特征来选择更适宜临床应用的间充质干细胞种类［3，4］。2014年2月至2015年1月作者选择人骨髓和脐带两种来源的MSC，比较其免疫表型及分泌细胞因子的差异，为临床应用提供参考。

1　临床资料

1.1骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的分离与培养 健康供者的骨髓（n=21）于无菌肝素抗凝管内离心弃上清液，用PBS重悬后与Ficoll分离液（挪威Axis-Shield）以5：3比例加入50ml离心管，1900r/ min，离心15min，吸取中间白膜层，用PBS洗涤2次后用10%FBS（加拿大Stemcell）、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的αMEM（美国Gibco）完全培养基重悬细胞，以3×105/cm2的密度接种于T75cm2细胞培养瓶（美国Corning），置于2.5%CO2的37℃培养箱中，2d后换液，之后换液2次/周至细胞汇聚度达80%～90%，吸弃培养液，每瓶加2.5ml0.25%胰酶EDTA钠溶液（美国Gibco），于培养箱消化8min后吸出所有液体加入等量的αMEM完全培养基中和，1200r/min］离心后获得P0代细胞，以细胞密度4×103/cm2传代扩增至P3代时进行免疫表型分析及细胞因子检测。

1.2脐带间充质干细胞（UC-MSC）的分离与培养 取来自足月剖宫产健康产妇的脐带（n=18）10cm左右置于含100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的PBS中浸泡，用PBS反复洗涤后剪成1cm左右长短的小块，再用PBS洗涤2遍，加入3倍体积的含0.2%Ⅳ型胶原酶（美国Worthington）的αMEM培养基，于37℃水平振荡器250r/min消化2h，后用αMEM培养基洗涤3遍去除胶原及胶原酶，用上述完全培养基重悬于2～4个T75cm2细胞培养瓶，后如上述消化传代至P3代进行免疫表型及细胞因子检测。

1.3BM-MSC及UC-MSC表面标志物的检测 取P3代的两种间充质干细胞制成单细胞悬液，分别加入鼠抗人PE标记的CD34、CD90、CD105、CD14、HLAABC及FITC标记的CD44、CD45、CD73、HLA-DR单克隆抗体（美国BD Pharmingen），常温避光孵育30min，后用PBS洗涤2遍，重悬于500μl PBS中用流式细胞仪检测。

1.4BM-MSC及UC-MSC分泌白细胞介素6（IL-6）的检测 分别收集两种MSC P3代培养前含10%FBS的αMEM完全培养基，以及细胞开始贴壁后第2、5、8、11、15、16、17天吸取培养瓶内的1ml上清液共8份标本作为检测对象于-20℃保存（11d后为细胞汇聚度≥90%时）。将收集的原始培养基及上清液PBS稀释100倍后用Miliplex试剂盒检测。

2　结果

2.1两种间充质干细胞免疫表型 两种间充质干细胞P3代表型特征相似，均高表达CD90、CD105、CD44、CD73及HLA-ABC抗原，均不表达CD14、CD34、CD45等造血细胞相关抗原，UC-MSC不表达HLA-DR抗原，BM-MSC低表达HLA-DR抗原，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）见表1。

表1　BM-MSC与UC-MSC表面抗原比较（x±s）

2.2两种间充质干细胞不同时间点分泌IL-6浓度 BM-MSC P3代在实验选取的各时间点分泌IL-6的量均高于UC-MSC的P3代（P＜0.05），且两种间充质干细胞P3代均在细胞贴壁24h后开始逐步升高，见图1。

3　讨论

不同组织来源的MSC具有相近的生物学特性，但较多研究也证实其不同特点，如脐带中MSC含量明显多于骨髓［5］，UC-MSC比BM-MSC有更快的增殖能力和更好的成骨分化能力，不同来源的MSC分泌的造血调控因子有差异［6］。本资料结果表明，BM-MSC和UC-MSC在体外分离培养无明显差别，但骨髓标本较难获得，也成为临床应用的阻碍，在细胞表面标志方面，BM-MSC低表达HLA-DR抗原，提示UC-MSC与其相比具有更低的免疫原性。两种间充质干细胞均在细胞贴壁24h后开始逐渐升高，也为临床治疗选用输注细胞的时间提供参考，另外，BM-MSC较UC-MSC分泌大量的IL-6，IL-6与免疫反应，感染以及支持造血均有密切关系，对造血干/祖细胞的分化发育起重要的调控作用［7］，提示BM-MSC在免疫调控方面可能更有优势。

1 Maxson S， Lopez EA， Yoo D，et al. Role of Mesenchymal Stem Cells in Wound Repair. Stem Cells Trans Med， 2012，1（2）：142～149.

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5 Weiss ML，Anderson C，Medicetty S，et al.Immune properties of human umbilical cord wharton's jelly-derived cells.Stem Cells，2008，26：2865～2874.

6 Majumdar MK， Thiede MA， Haynesworth SE， et al. Human marrowderived mesenchymal stem cells （MSCs） express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J Hematother Stem Cell Res，2000， 9（6）：841～848.

7 Sitnicka E，Lin N，Priestley G V，et al . The effect of thrombopoietin on the proliferation and differentiation of murine hematopoietic stem cells. Blood，1996，87（12）：4998～5005.

AIM To compare in vitro isolation﹑culture﹑immune phenotype and the concentrations of interleukin-6（IL-6）of the third passage of human bone marrow mesenchymal stem cells（BM-MSC） and umbilical cord tissue mesenchymal stem cells（UC-MSC）.METHODS Flow cytometry and Miliplex kit were used for the determination of phenotype and the concentrations of IL-6. RESULTS Two kinds of cells of P3 generation were high expression of CD90，CD105，CD44，CD73 and HLA-ABC antigens were not expressed CD14，CD34，CD45 and other hematopoietic cell related antigen. UC-MSC did not express HLA-DR antigen，BM-MSC low expression of HLA-DR antigen. BM-MSC at different time points of IL-6 secretion of hormone concentrations were higher in UC-MSC，both of which were gradually increased.CONCLUSION UC-MSC have lower immunogenicity，BM-MSC in the immune regulation has more advantages.

Bone marrow mesenchymal stem cells Umbilical cord mesenchymal stem cells Immune phenotype Interleukin 6

江苏省科教兴卫工程-临床医学中心（ZX201102）；江苏省科技厅生命健康专项-BL2012005

215006 苏州大学附属第一医院