猪苓菌丝体发酵条件的优化

豆宏瑶，高慧娟，黄金梅，杨国红，徐建梅

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

猪苓菌丝体发酵条件的优化

豆宏瑶，高慧娟*，黄金梅，杨国红，徐建梅

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000）

以菌丝体干重为评价指标，研究不同发酵条件对猪苓菌丝体干重的影响。试验采用了液体摇瓶培养的方法，在不同的温度、pH、装液量和培养时间的条件下，测定猪苓菌丝体干重的，确定各单因素条件下猪苓菌丝体的最佳发酵条件，再采用L9（34）正交试验设计优化菌丝体发酵条件。结果表明，当温度为25℃、装液量为100 mL/250 mL、pH为5.5、培养时间11 d时，为菌丝体最优发酵条件，进一步在此条件下进行验证性试验得菌丝体干重为1.023 g/100 mL，说明通过优化发酵条件，可以有效提高猪苓菌丝体干重量。

猪苓；菌丝体：液态发酵；正交试验

猪苓Polyporus umbellate（Pers.）Fries属真菌门，多孔菌科，猪苓（地花）属，别名野猪粪［1］。猪苓作为常用中药，在我国已有2000多年的入药历史。现代医学研究表明，猪苓具有利尿、抗肿瘤、保护肝脏、增强免疫力、抗辐射等作用［2-3］。除多糖外，甾体类为其主要化学成分，生物活性多样，几乎无毒副作用，在临床上具有广泛用途和良好疗效，是一种很具开发潜力的常用中药［4］。

近年来猪苓的药用价值越来越受到人们的重视［5］。由于猪苓以野生为主，野生产量日渐匮乏，人工栽培的时间短，产量低，引种产量少，致使猪苓的上市量呈逐年下滑之势，猪苓的人工栽培也面临着严峻的挑战，而采用液态发酵技术大规模培养菌丝体，培养过程容易控制，且成本低，可以获得大量菌丝体［6］，而猪苓菌丝体量受环境条件的影响较大［7］，本研究通过单因素试验和正交试验优化菌丝体发酵条件，为大批量生产猪苓菌丝体提供一定的参考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1仪器

HZQ-X400型恒温振荡培养箱：太仓市华美生化仪器厂；DHP-9162型电热恒温培养箱、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司；CL-32L型高压灭菌锅：ALP公司；5A2003型精密电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；pH分析测量仪：上海盛磁仪器有限公司；SKJH-2112型超净工作台。

1.1.2菌株

猪苓：河西学院应用真菌工程实验室提供。

1.1.3化学试剂

95%乙醇，葡萄糖，琼脂，NaOH，HCl均为分析纯。

1.1.4培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加水定容至1 000 mL。

1.2方法

1.2.1PDA培养基的配制

马铃薯洗净，去皮挖眼，切成2 cm2的小块，放入水中煮沸30 min，用玻璃棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加入葡萄糖2%，琼脂2%，加自来水定量至1 000 mL，pH为自然。

1.2.2菌种活化

将保存于4℃冰箱中的猪苓种菌块接入新鲜的固体斜面培养基上，置于28℃恒温培养箱中避光培养8天后，再转接一次，28℃培养待菌丝长满斜面时，置于4℃冰箱备用。

1.2.3发酵条件对菌丝体干重的影响

1.2.3.1温度对菌丝体干重的影响

在250 mL三角瓶中，加入100 mL的PDA培养基，115℃湿热灭菌20 min，冷却至室温后，接入3片6 mm的菌丝块。置于130 r/min的恒温培养振荡器上，分别在22、25、28、31、34℃的条件下进行培养，每个温度梯度设3个平行。8天后测定菌丝体干重，以确定菌丝体最佳发酵温度。

1.2.3.2装液量对菌丝体干重的影响

在250 mL三角瓶中，分别加入50、75、100、125、150 mL的PDA培养基，115℃湿热灭菌20 min，冷却至室温后，接入3片6mm的菌丝块。每个装液量梯度设3个平行，采用1.2.3.1的最佳发酵温度置于130 r/min的恒温培养振荡器上进行培养。8天后测定菌丝体干重，以确定菌丝体最佳发酵装液量。

1.2.3.3pH对菌丝体干重的影响

在250 mL三角瓶中，加入1.2.3.2的最佳装液量的培养基，115℃湿热灭菌20 min，冷却至室温后，接入3片6 mm的菌丝块。设置pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 5个梯度，每个梯度设3个平行。以1.2.3.1的最佳发酵温度，置于130 r/min的恒温培养振荡器上进行培养，8天后测定菌丝体干重，以确定菌丝体最佳发酵初始pH。

1.2.3.4发酵时间对菌丝体干重的影响

在250 mL三角瓶中，加入1.2.3.2的最佳装液量的培养基，将pH调至1.2.3.3的最佳pH，115℃湿热灭菌20 min，冷却至室温后，接入3片6 mm的菌丝块。以1.2.3.1的最佳发酵温度置于130 r/min的恒温培养振荡器上培养，培养时间分别设定为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，同一培养时间设定3个平行。测定菌丝体干重，以确定最佳发酵时间。

1.2.4菌丝体干重的测定

摇床培养结束后，将发酵液过滤，蒸馏水反复洗涤菌球后，置于55℃烘箱中烘干至恒重，称重得到菌丝体干重。

1.2.5猪苓菌丝体发酵条件正交试验的设计

在单因素试验基础上，采用正交试验，以发酵的温度、装液量、pH和培养时间为考察因素进行优化发酵条件的设计，每因素选取3个水平，设计因素水平见表1。

表1　猪苓菌丝体发酵条件的正交试验设计Table 1Fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellate by orthogonal experimental design

2结果与分析

2.1温度对猪苓菌丝体生长量的影响

培养温度22℃～32℃范围内猪苓菌丝体均能生长，在22℃～25℃内菌丝体量变化不大，在25℃～28℃内菌丝体量呈明显增长趋势，28℃菌丝体含干重达最大值，28℃后又呈现下降趋势，结果见图1。

图1　温度对猪苓菌丝体生长量的影响Fig.1Effect of Temperature on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由图1可知菌丝体量随温度的上升而下降，这可能是高温引起某些酶失活进而影响了菌丝体的生长，低温会影响物质的溶解性，物质只有溶于水才能被菌丝体吸收，物质的溶解度随温度变化而变化，最终影响菌丝体生长，低温也会影响细胞质膜的流动性［8］，温度的变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。由此得到猪苓菌丝体的最佳发酵温度为28℃。

2.2装液量对猪苓菌丝体的生长量的影响

在猪苓液体发酵过程中，猪苓菌丝体干重量呈弓形趋势变化，装液量为50 mL～100 mL时，菌丝体量随装液量的增加而不断上升；装液量为100 mL时，猪苓菌丝体干重达最大值；装液量为100 mL～150 mL时，菌丝体量随装液量的增加而不断减少，结果见图2。

图2　装液量对猪苓菌丝体生长量的影响Fig.2Effect of fluid volume on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由图2可知，说明装液量少，发酵液中氧气的交换率较强，有足够的空间提供氧气量，菌丝体生长旺盛；装液量多，氧气交换率较弱，供氧空间越来越小［9］，越不利于猪苓菌丝体的生长。由此得到猪苓菌丝体发酵的最佳装液量为100 mL。

2.3pH对猪苓菌丝体生长量的影响

猪苓菌丝体量在初始pH3.5～pH4.5之间呈上升趋势，在pH4.5时菌丝体干重达到最大值，pH4.5以后菌丝体量又呈现下降趋势，结果见图3。

图3　发酵pH对猪苓菌丝体生长量的影响Fig.3Effect of pH on fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由图3可知，初始pH太大或太小均不利于胞外多糖的形成，一般认为，微生物机体内的绝大多数反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH，低于或高出这个范围，其生长就会受到抑制，并且环境中的酸碱度也会影响到菌丝体细胞膜的渗透性以及膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性。猪苓菌丝体发酵的最适pH为4.5，这与真菌一般偏酸性环境生长，最适pH多为4.0～6.0相一致。由此得到猪苓菌的最适发酵pH为4.5。

2.4培养时间对猪苓菌丝体生长量的影响

菌丝体量随着培养时间的增加不断增大，6天之前菌丝体量少且变化不大，6 d～9 d菌丝体量呈上升趋势且显著增多，培养到10天时菌丝体干重达到最大值，10天后菌丝体量略呈现下降趋势，结果见图4。

图4　培养时间对猪苓菌丝体生长量的影响Fig.4Effect of Culture time fermentation conditions for mycelium of polyporus umbellate

由图4可知，分析记录菌丝体的生长状况，菌丝体在培养7天后其生长速度加快，菌丝洁白、生长旺盛，在培养11天后，菌丝体逐渐变成灰白色［10］，生长速度也变得缓慢，意味着菌丝体生长速度减缓，开始老化现象。由此得到猪苓菌的最适培养时间为10 d。

2.5正交试验结果分析

由表2可知，各因素的极差不相等，因素C的极差最大，因素D的极差的最小，这说明各因素水平改变对试验结果的影响是不相同的，极差越大，表示该列因素的数值在试验范围内的变化，将导致试验指标在数值上具有更大的变化［11］。通过正交试验极差分析法获得优化方案A1B2C3D3，即在温度25℃下加入pH 5.5的PDA培养基100 mL/250 mL置于液体摇床发酵11 d测得菌丝体干重为1.023 g/100 mL。对比正交试验9个方案中的5号方案A2B2C3D1，发现其与优化方案的发酵条件非常相似，但菌丝体含量远不及验证试验的菌丝体含量。优化方案并不包含在正交表中已做过的9个试验方案中，这正体现了正交设计表的优越性。

表2　正交试验结果Table 2The result of orthogonal experimental

对正交试验进行方差分析，结果显示，初始pH和装液量对结果的影响极显著，温度对结果的影响显著，时间对结果的影响差异不显著，结果见表3。

表3　正交试验的方差分析表Table 3Variance analysis of orthogonal experiment

因此确定液体发酵猪苓的最佳条件为温度25℃，装液量100 mL，pH5.5，培养时间11 d。

3结论

不同单因素对菌丝体干重的影响不同，经过单因素试验得到温度为28℃时，菌丝体干重达最大值0.435 g/100 mL；装液量为100 mL时，菌丝体干重达最大值0.639 g/100 mL；pH为4.5时，菌丝体干重达最大值0.639 g/100 mL；培养时间为10 d时，菌丝体干重达最大值0.479 g/100 mL。

在单因素试验的基础上，进行正交试验优化最佳发酵条件为：温度25℃、pH5.5、装液量100 mL及发酵11 d，通过验证试验测得菌丝体干重为1.023 g/100 mL，对比正交试验方案中最高值0.908 g/100 mL增加了12.6%，说明优化猪苓菌丝体发酵条件能够有效的提高菌丝体量。

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Optimization of Fermentation Conditions for Mycelium of Polyporus umbellate

DOU Hong-yao，GAO Hui-juan*，HUANG Jin-mei，YANG Guo-hong，XU Jian-mei
（College of Agriculture＆Biotechnology，Hexi University，Zhangye 734000，Gansu，China）

The study aim to obtain the optimal of fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus by investigating effects of different fermentation conditions on mycelium of Polyporus umbellatus，with mycelium as an indicator.In this study，the liquid shake flask culture method was used.In different conditions（various temperatures，pH，fluid volume and incubation times），the mycelium of Polyporus umbellatus was determined to find the best fermentation condition for fermentation in each single factor.Subsequently，the mycelium fermentation conditions were optimized by using L9（34）orthogonal experiment design，and the results showed that the optimal fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus were temperature of 25℃，pH of 5.5，incubation time of 11 d and fluid volume of 100 mL/250 mL.So，content of mycelium of Polyporus umbellatus reached the maximum 1.023 g/100 mL，suggesting that optimization of fermentation conditions for mycelium of Polyporus umbellatus could effectively improve content of mycelium of Polyporus umbellatus.

Polyporus umbellatus；mycelium；liquid fermentation；orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.028

2014-03-04

豆宏瑶（1995—），女（汉），在读本科生，研究方向：食品工程。

高慧娟（1977—），女（汉），副教授，硕士研究生，研究方向：微生物发酵。