一例猪瘟、高致病性猪蓝耳病、猪伪狂犬病混合感染的实验室诊断

蔡雨函，周远成，艾 能，李 碧，潘 梦

（四川华神兽用生物制品有限公司 四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都 610299）

一例猪瘟、高致病性猪蓝耳病、猪伪狂犬病混合感染的实验室诊断

蔡雨函，周远成*，艾 能，李 碧，潘 梦

（四川华神兽用生物制品有限公司 四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都 610299）

对南充市某猪场的一起疫情进行确诊，采集病死仔猪的病料进行实验室检查。PCR结果显示猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病毒均为阳性。试验结果表明，该猪场疫情是由CSFV、PRRSV和PRV混合感染所致。

猪瘟；高致病性猪蓝耳病；猪伪狂犬病；混合感染

2015年3月中旬，南充市某小规模猪场仔猪发生了以高热、食欲废绝、皮肤发红、腹泻、后躯麻痹、有个别呼吸困难为主要特征的传染病。解剖后观察可见脑膜明显充血、水肿，脑脊髓液增多；全身淋巴结肿大、出血，呈大理石状；肾脏呈土黄色、有点状出血；喉头、气管和支气管有黏液性泡沫并充血；肝脏、脾脏有坏死灶；回盲口见一个个轮层状溃疡。查看该群仔猪的免疫记录： 30日龄、60日龄时各免疫注射1次猪瘟疫苗， 45～60日龄接种猪丹毒与猪肺疫二联疫苗、链球菌疫苗。母猪空怀期注射过猪瘟疫苗、链球菌疫苗， 但没有注射猪伪狂犬病和猪蓝耳病疫苗。该场发病后使用抗生素治疗，均无效果。实验室诊断确诊为猪瘟（CSFV）、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪伪狂犬病毒（PRV）混合感染，现报告如下，以期为今后猪病的诊断和防控提供参考。

1　材料与方法

1.1病料采集

无菌采集死亡仔猪的颌下淋巴结、脾脏、肺脏、扁桃体、脑等组织。

1.2试验试剂

2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000购自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa RNAiso Plus、PrimeScript RT Kit、2×GC buffer、 dNTP、Mg2+、rap 酶购自大连宝生物工程有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.3引物设计

根据GenBank中CSFV和PRV的核酸序列分别设计引物，其中CSFV阳性扩增片段为270 bp，PRV阳性扩增片段为192 bp。参照周丹（2012）建立的鉴别诊断PRRSV普通株与变异株RT-PCR方法，区分是经典PRRSV感染还是高致病性PRRSV感染（猪蓝耳病病毒普通株扩增片段为267 bp，变异株扩增片段为180 bp）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（见表1）。

1.4细菌学检测

1.4.1触片镜检 将无菌采集的病料触片后革兰氏染色镜检。

1.4.2分离培养 将无菌采集的病料接种于普通营养琼脂平板于37 ℃恒温箱中培养24 h后，观察菌落生长情况。

1.5核酸提取

1.5.1总DNA的提取

取适量病变肺脏和脑组织置于研钵中，加入3～5倍体积的磷酸缓冲液（PBS）研磨成匀浆，-20 ℃反复冻融3次，取200 µL悬液加入蛋白酶K（终浓度为200 µg/mL），56 ℃水浴30 min；再加入等体积的Tris平衡酚，反复颠倒混匀；室温 12 000 r/ min 离心10 min；吸取上清转移到新的离心管中，加入苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25∶24∶1的混合液重复上述抽提步骤；转移上清到新的离心管中，加入氯仿/异戊醇体积比为24∶1的混合液重复上述抽提步骤；向最后获得的上清液中加入2倍体积的无水乙醇沉淀 DNA，室温12 000 r/min离心10 min，再用 500 µL 700 mL/L乙醇洗涤1次；轻轻弃去无水乙醇，自然风干，溶解于20 µL TE中，-20 ℃保存备用。

1.5.2总RNA的提取与cDNA的合成

取适量的颌下淋巴结、脾脏、肺脏、扁桃体放入匀浆器里，加入1 mL TRIZOL裂解液进行匀浆，匀浆充分后室温静置5 min，l2 000 r/min，离心5 min；取上清液，加入200 mL氯仿 （迅速振荡），室温静置5 min，12 000 r/min，离心 15 min；向最后获得的上清液中加入等量异丙醇沉淀RNA，轻轻摇晃混匀，室温作用10 min后，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，加1mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min离心5 min，轻轻弃去无水乙醇，自然风干，溶解于20 µL 无Rnase水中，-20 ℃保存备用。按照宝生物工程（大连）有限公司RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，将反转录产物于-20 ℃保存备用。

1.6猪繁殖与呼吸综合征病毒检测

反应体系为：引物稀释浓度为20 µmol/L，Primer Mix 1.5µl（P1∶P2∶P3=1∶1∶2），2×Mix 12.5 µL，cDNA 3 µL，加ddH2O至25 µL，反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃再延伸10 min。同时设立阴性对照，PCR 产物用 10 g/L琼脂糖凝胶进行鉴定。

1.7猪瘟病毒检测

利用套式PCR技术检测CSFV，其中第一轮PCR反应体系为：P4、P5（10 µmol/L）各 0.5 µL，2×Mix 12.5 µL，cDNA 2.5 µL， 加ddH2O至25 µL。第二轮PCR反应体系为：P6、P7（10 µmol/L）各 0.5 µL，2×Mix 12.5 µL，第1轮PCR产物1 µL，加ddH2O至25 µL。反应条件均为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，最后72 ℃再延伸10 min。同时设立阴性对照，PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶进行鉴定。

1.8猪伪狂犬病毒检测

采用25 µL体系进行PCR 反应， 其 中P8、P9（20 µmol/L） 各0.5 µL，2×GC buffer 12.5µl，dNTP 4µl， Mg2+1.5µl， rap 酶0.5µl， ddH2O 4.5 µL，DNA 1 µL。反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃再延伸10 min。同时设立阴性对照，PCR 产物用 10 g/L琼脂糖凝胶进行鉴定。

2　结果

2.1细菌分离

触片镜检未见细菌，分离培养后无菌落生长，表明该猪场疫病不是由细菌感染所致。

2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒检测

电泳结果（见图1）显示从病料中扩增出180 bp的电泳条带，表明为高致病性PRRSV感染阳性。

2.3猪瘟病毒检测

电泳结果（见图2）显示从病料中扩增出270 bp的电泳条带，表明为猪瘟病毒感染阳性。

2.4猪伪狂犬病毒检测

电泳结果（见图3）显示从病料中扩增出192 bp的电泳条带，表明为猪伪狂犬病毒感染阳性。

3　讨论

根据实验室检查结果，病猪体内未分离出任何细菌，即排除了由细菌感染所致；CSFV、PRRSV RT-PCR和PRV PCR检测结果均为阳性，且结果显示PRRSV为PRRSV变异毒株，因此本次疫病确诊为猪瘟、高致病性猪蓝耳病和猪伪狂犬病混合感染。本次疫情可能主要是由于该猪场没有免疫猪伪狂犬病和猪蓝耳病疫苗导致猪群患病，而猪伪狂犬病和猪蓝耳病通过破坏机体免疫系统会干扰猪瘟抗体产生，使猪瘟抗体水平大幅下降， 从而使猪群亦受到猪瘟病毒感染。因此，在做好猪瘟防疫工作的同时更要高度重视猪伪狂犬病和猪蓝耳病的防疫工作。

图1　PRRSV检测结果

图2　CSFV检测结果

图3　PRV检测结果

猪瘟、猪伪狂犬病是当前困扰我国猪场的主要病毒性疫病，管理不好的猪场猪蓝耳病也会长期存在，使症状往往由典型转为慢性经过，给治疗带来很大难度。因此，平时要坚持做好基础免疫工作，提高抗体水平。搞好猪舍的环境卫生工作，做好保温和通风换气工作，适当降低保育猪的饲养密度，保证饲料营养的充足和均衡，给猪创造一个良好的营养和生长环境。疫情发生并确诊后立即向上级兽医部门汇报，制定紧急防疫措施；及时隔离发病猪，严格观察可疑猪，对死亡病猪进行无害化处理以防病原传播，对猪场进行全面消毒处理，控制细菌继发感染；同时加强猪群的疫苗免疫，并使用干扰素和抗病毒药物进行治疗。发病后及时隔离治疗病猪、果断淘汰带毒猪是净化猪群、控制持续感染的关键措施。

随着养猪业规模化和集约化发展，近些年发生的猪传染病，大多为多种因素导致多种病菌并发、继发或混合感染，其中病原体的混合感染既有细菌+细菌，也有病毒+病毒和细菌+病毒，并造成一些猪传染病以非典型或综合征的形式出现，使猪病的诊断和防治的难度增加，给养殖业造成较大影响，严重影响了养殖业的发展。针对目前规模化猪场疫病的复杂局面，要树立保健和预防观念，采取合理的免疫程序，建立完善的预防方案。同时对患猪制定科学的用药方案，正确配伍，协同用药，辨证施治，综合治疗。

2015-07-21）

蔡雨函（1990-），女，四川南充人。

周远成，博士，主要从事动物传染病病原分子生物学研究，E-mail：abtczyc@163.com