冷却牛肉表面微生物分离、监测与初步鉴定

苏远科 王志宏 吕斐 罗晓 崔常勇

（龙口出入境检验检疫局 山东龙口 265700）

冷却牛肉表面微生物分离、监测与初步鉴定

苏远科 王志宏 吕斐 罗晓 崔常勇

（龙口出入境检验检疫局 山东龙口 265700）

［目的］对冷却肉表面的微生物进行分离、检测与鉴定，为冷却肉微生物安全评价和预测预报提供技术支撑。［方法］采用基础培养基和选择性培养基对普通冷却牛肉表面主要微生物菌群进行分离、筛选，并利用用API条或VITEK2 Compact进行菌株的初步鉴定。［结果］本研究共分离13株表面微生物，其中G+菌株6株，G—菌株7株；G+菌中2株为乳酸菌属、1株为索丝菌属、3株为李斯特氏菌属；G—菌中4株为肠杆菌科、3株为假单胞菌属。［结论］冷却牛肉表面存在多种致腐败微生物，应对冷却牛肉建立合理的监测、预测及预报系统。

冷却牛肉；微生物分离；微生物监测；鉴定

1 前言

冷却肉是按照严格的宰前检疫、宰后检验的要求，采取合理的屠宰加工工艺流程，在低温环境下进行分切加工，使屠宰体中心肉温在24 h内迅速降至4℃以下，并在加工、运输及销售过程中始终保持低温冷藏链的预冷加工肉［1，2］。近年来冷却肉在大中城市的市场上已经有一定的市场份额，且其将可能成为我国生肉消费的主流。虽然冷却肉处于低温环境下，能有效抑制微生物的生长及繁殖，但是，由于内源性污染和外源性污染的因素，冷却肉也会受到一些致腐败微生物的污染［3-5］。健康牲畜的身体表面、呼吸道、免疫器官及上呼吸道等部位均存在一些内源性的微生物，可能会对冷却肉造成影响。同时，加工过程中的用水、加工环境中的空气以及从业人员等均可能对冷却肉造成外源性污染［6］。本研究对部分冷却肉表面的微生物进行分离、检测与鉴定，为冷却肉微生物安全评价和预测预报提供技术支撑。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1试验样品

冷却牛肉购自龙口家家悦超市未包装冷却牛肉。

2.1.2仪器与设备

均质仪：日本ELMEX公司产品；培养箱：德国MEMERT公司产品；高压灭菌器：日本YAMATO公司产品；显微镜：德国莱卡公司产品。

2.1.3试剂

无菌均质袋、3M涂膜棒、培养基：均购自北京陆桥技术有限责任公司。

2.2方法

2.2.1样品处理

从肉块表面取样，参照GB/T4789.17-2003《食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验》使用灭菌棉拭子擦拭法，使用10个棉拭子共擦拭50 cm2，然后投入盛有50 mL无菌水的三角瓶中充分震荡摇匀立即检测。取均匀液1 mL按照10×递增稀释至10-5浓度，每个稀释度重复3次，倾注平板计数。

2.2.2计数与菌株分离

采用营养琼脂进行细菌总数测定，培养温度30℃，培养时间72 h。特定的微生物种群分离采用特定的培养基及培养温度，见表1。

表1　特定微生物种群的分离培养基及分离温度

2.2.3分离纯化与鉴定

在表1的选择性培养基上挑选典型菌落，并在对应的选择性培养基上反复划线分离培养，获得纯化的单菌落用于菌种或属的鉴定。菌种或属的鉴定采用生物梅里埃公司的API条和VITEK Compact2全自动细菌鉴定仪进行鉴定。

2.2.4微生物菌落总数测定

细菌总数参考GB4789.2-2013《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》要求进行检测，计数平板为琼脂，培养温度为37℃，培养时间2 d。

3 结果

3.1不同时间取样微生物计数分析

本研究发现随着时间的延长，冷却肉表明的微生物总数逐渐增加，但是随着时间延长，菌落总数趋于稳定，见图1。

图1　不同时间取样微生物总数计数分析

3.2分离获得的6株革兰氏阳性菌菌落特征分析

本研究分离的13株菌中革兰氏阳性菌有6株，且均无芽孢；6株菌株中有杆菌3株，球菌或卵圆形菌3株；表面湿润的菌株有3株，表面粘稠的菌株有3株；6株菌株中均不透明。详见表2。

表2　分离获得的6株革兰氏阳性菌菌落特征分析

3.3分离获得的7株革兰氏阴性菌菌落特征分析

本研究分离的13株菌中革兰氏阴性菌有7株，且均无芽孢；7株菌株中均为杆菌；表面湿润的菌株有3株，表面呈现奶油状的菌株有4株；7株菌株中均呈现半透明状。详见表3。

表3　分离获得的7株革兰氏阴性菌菌落特征分析

3.4API条及全自动细菌鉴定仪鉴定分型

本研究分离的13株表面微生物中G+菌株6株，G—菌株7株。6株G+菌中2株为乳酸菌属、1株为索丝菌属、3株为李斯特氏菌属；7株G—菌中4株为肠杆菌科、3株为假单胞菌属。

4 讨论

冷却肉是目前市场上的重要的肉类产品，其市场占有率有逐年升高的趋势。冷却的主要作用是将环境温度降低到微生物能够生长或繁殖的温度以下，降低微生物体内的代谢酶活性，抑制生长速度、延长繁殖时间。如果环境温度降低至最低生长温度界限时，微生物则彻底停止生长。比如在3℃条件下，肉类产品中的主要致病微生物如金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌及沙门氏菌等均生长停止。不同微生物的生长特性不同，因此，不同温度下肉类食品中微生物菌群的构成会有较大的差异性［7，8］。

冷却牛肉处在一系列的低温条件下，能够抑制大多数微生物的生长，因此，随着储存时间延长，菌落总数不会剧烈增加。本研究中也发现菌落总数会随着保存时间的延长而增大，却不会呈现指数级别的增加。虽然低温可以抑制大多数微生物的生长，但是冷却肉中的一些腐败细菌，如假单胞菌属、气单胞菌属、肠杆菌科细菌及乳酸杆菌等却可以生长，本研究结果菌落总数会随着时间的延长而增加也证实了这一点。李斯特氏菌为兼性厌氧菌，为革兰氏阳性菌，是土壤中的腐生菌，能以死亡或腐烂的有机物为食。此外，李斯特氏菌主要以食物为传染媒介，是主要的食源性病原菌。目前，已有的研究证实李斯特氏菌可以引起肉类、蛋类、乳制品、海产品及禽类等的腐败变质。在对河北省即食食品中单增李斯特菌菌污染及耐药性的研究中发现单增李斯特菌的总污染率达到1.34%，且对15中抗生素的耐药率达到13.97%，其耐药性还有逐步增长的趋势［9］。在对呼和浩特市单增李斯特氏菌污染的调查分析中也发现呼和浩特市市售食品单增李斯特氏菌的阳性率达到4.71%，且散装食品污染更为严重［10］。本研究也发现冷却牛肉中的单增李斯特氏菌是表面污染菌的重要组分，且比例达到了23.4%（3/13）。另外，假单胞菌属也是引起肉类腐败的重要菌类［11］。同时，在对食源性假单胞菌16S rRNA鉴定及食品腐败特性的研究中也发现了三株从市售鱼中分离的假单胞菌，且均具有蛋白水解活性、生物膜形成能力及嗜铁素产生能力［12］。本研究中分离的13株冷冻肉表面的微生物中假单胞菌属也占到3株，因此，假单胞菌属也是引起肉类腐败的重要微生物。

5 结论

冷却牛肉处在一系列的低温条件下，能够抑制大多数微生物的生长，但一些腐败细菌，如假单胞菌属、气单胞菌属、肠杆菌科细菌及乳酸杆菌、李斯特氏菌等却可以生长。因此，冷却牛肉表面存在多种致腐败微生物，应对其建立合理的监测、预测及预报系统。

［1］刘蒙佳，周强，林海虹.三种天然香辛料液对冷却肉保鲜效果的研究［J］.肉类工业，2013，11：43-48.

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［4］金鑫，周光宏，徐幸莲.冷却肉微生物腐败与冷链系统［J］.食品工业科技，2012，06：417-420.

［5］宋志鹃，黄素珍.冷却肉的微生物控制及保鲜技术的研究进展［J］.肉类研究，2009，06：31-36.

［6］杨兴章，曹振辉，乔金玲.冷却肉生产过程中微生物污染及控制措施［J］.肉类研究，2007，07：26-28+37.

［7］熊振海，马晨晨.冷却牛肉货架期及微生物多样性分析［J］.食品安全质量检测学报，2014，07：2109-2113.

［8］刘寿春，赵春江，杨信廷，等.基于微生物危害的冷却猪肉加工过程关键控制点分析与控制［J］.食品科学，2013，01：285-289.

［9］张淑红，侯凤伶，关文英，等.2005-2013年河北省即食食品中单增李斯特菌污染及耐药特征研究［J］.中国食品卫生杂志，2014，06：596-599.

［10］周虓，李萍，胡瑞林，等.2010-2013年呼和浩特市食品中单核细胞增生李斯特氏菌污染调查分析［J］.热带医学杂志，2014，06：824-826.

［11］蔡双福，张琴，黄耀雄.食品中铜绿假单胞菌的监测分析［J］.中国卫生检验杂志，2015，06：875-876+905.

［12］綦国红，董明盛，陈晓红，等.食源假单胞菌16S rRNA鉴定及其食品腐败特性的研究［J］.食品工业科技，2006，11：49-51.

The Isolation，Detection and Identification of Surface Microorganism in Chilled Beef

Su Yuanke，Wang Zhihong，Lv Fei，Luo Xiao，Cui Changyong
（Longkou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Longkou，Shandong，265700）

［Objective］The present research aimed to propose a technical support for chilled meat by isolating，detecting and identifying the surface microorganism in chilled beef.［Methods］The surface microorganisms were isolated by basal culture medium and selective medium.The stain was detected by API or VITEK2 Compact instrument.［Results］13 stains were isolated in the present research，which containing 6 gram-positive stains and 7 gram-negative stains.The present research also showed that 13 stains contained 2 stains lactobacillus，1 stain of Brochothrix，3 stains of Listeria Monocytogenes，3 stains of Pseudomons and 4 stains of Enterobacteriaceae.［Conclusion］Various kinds of microorganisms were exists in chilled beef and rational forecast system must be build in order for good operation.

Chilled Beef；Microorganism Isolation；Microorganism Detection；Identification

TS207.4

E-mail：suyuanke@163.com

2015-10-21