不同加样方式对ELISA竞争法检测乙肝核心抗体的影响

俞胜琴

（江宁区第二人民医院检验科，江苏 南京 211100）

不同加样方式对ELISA竞争法检测乙肝核心抗体的影响

俞胜琴

（江宁区第二人民医院检验科，江苏 南京 211100）

目的 探讨不同加样方式对酶联免疫吸附试验竞争法检测乙肝核心抗体结果的影响。方法 收集132例门诊和住院患者血清样本，运用ELISA竞争抑制法，按照3种不同的加样方式检测乙肝核心抗体进行对照。结果 加样方式1的阳性率为12.12%；加样方式2的阳性率为14.39%；加样方式3的阳性率为28.78%。三种不同的加样方式，阳性检出率各不相同。结论 三种不同的加样方式对ELISA竞争法检测乙肝核心抗体的检测结果不同。加样方式1是标准的加样方式，准确性高；加样方式2与加样方式1相比较无统计学意义，结果无明显差异；加样方式3与加样方式1相比较有统计学意义，结果有明显差异。

酶联免疫吸附试验；竞争法；乙肝核心抗体；阳性检出率

乙型肝炎核心抗体是乙肝病毒感染的指标，它的出现提示机体正在感染或既往感染过乙肝病毒。因此，乙肝核心抗体的检测在乙型肝炎的诊治方面具有十分重要的作用[1-2]。ELISA法检测乙肝病毒核心抗体已成为应用最广泛的免疫检测技术。ELISA竞争法是检测乙肝病毒核心抗体的常用方法，在临床实验室中广泛应用。本文运用ELISA竞争法检测132例门诊及住院患者乙肝核心抗体为例，以不同的加样方式对ELISA竞争法的影响进行实验和评价，分析其对乙肝核心抗体阳性检出率的差异。

1　材料与方法

1.1标本：随机抽取2014年4～6月，132例门诊和住院患者血清样本，清晨空腹采集患者的静脉血5 mL，患者年龄段为22～50岁，平均38岁；标本无溶血、脂血、黄疸等。

1.2试剂及仪器：核心抗体ELISA竞争抑制法检测试剂盒，产家由北京万泰药业股份有限公司提供，酶标仪（KHB KT-360）和洗板机（KHB KT-36W）均由上海科华实验系统有限公司提供。

1.3方法

1.3.1采血2 h后，离心分离血清，2～8 ℃冰箱保存，48 h内完成测试。

1.3.2加样方式1：用可调加样器调至100 μL，吸取100 μL血清放入试管底部，用吸管取0.9%氯化钠3 mL混匀（1∶30倍稀释）。每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔，空白对照1孔，微孔按序编号。分别在相应孔中加入待测样品及阴、阳对照各50 μL，空拍孔不加；加样方式2：血清不稀释，每孔直接加入血清10 μL，各设阴、阳及空白对照；加样方式3：血清不稀释，每孔直接加入血清50 μL，各设阴、阳及空白对照[3]。

1.3.3加酶：每孔均加入酶标试剂50 μL，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37 ℃，温育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干[4]。每孔加入显色剂A、B液各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀，10 min内用酶标仪在450 nm波长处，用空白孔调零点后测定各孔A值。

1.3.4统计：进行统计学处理，通过χ2检验，P＞0.01，无统计学意义；P＜0.01，有统计学意义。

2　结 果

2.1实验结果：“加样方式1的阳性率为12.12%；加样方式2的阳性率为14.39%；加样方式3的阳性率为28.78%。”

2.2三种不同加样方式检测132例乙肝核心抗体结果分析：见表1、2。

表1　方法2与方法1检测乙肝核抗体结果比较

表2　方法3与方法1检测乙肝核抗体结果比较

3　讨 论

ELISA竞争抑制法的原理，是将抗原包被反应板，加入待检标本与酶标液的单克隆抗体二者竞争结合固相抗原，即酶标抗体和标本抗体在同样的反应体系中与固相抗原等比竞争结合，温育后洗涤加入显色剂，显色的强弱与待检标本中抗体的含量成反比[5]。ELISA竞争法是检测乙肝核心抗体实验简单、实用、实验要求条件低、易于操作，是被临床广泛应用的经典实验。以上实验可以说明：

3.1三种不同的加样方式运用ELISA竞争抑制法的原理对乙肝病毒核心抗体进行检测，加样方式不同，检出的阳性率也有差异。

3.2加样方式1操作流程较复杂，血清标本要经过1∶30倍的稀释。稀释时，每人需要一支试管，当样本量大时，会造成一定的人力、物力的浪费。但此加样方式准确性高，临床可靠，是标准的加样方式，公认的检测方法。

3.3加样方式2是直接加入血清10 μL，其加样方式和标准加样方式1二者检测的结果，经过统计学分析与比较：χ2=0.16，0.5＜P＜0.75，P＞α=0.05，乙肝病毒核心抗体阳性率无明显差异，变化不显著。此法虽不是标准的加样方式，当进行大规模的体检时，即检测的样本量很大时，运用此法，省去了加样方式1的血清标本1∶30倍稀释的繁琐程序，在一定程度上具有操作简单、省时、经济、环保的特点，提高了工作效率。

3.4加样方式3是直接加入血清50 μL。实验表明，与标准的加样方式1相比较：χ2=11，P＜0.005，P＜α=0.05。两方法的结果有统计学意义，乙肝病毒核心抗体的阳性率明显上升，差异显著。导致此结果可能是以下几个方面的原因：①当直接加入50μL血清标本时，乙肝病毒核心抗体的酶标抗体-HBc与反应板上包被的固相抗原HBcAg结合机会有所减少，从而严重影响结果的检测；②抗原与抗体的特异性结合，是有一定的比例性，当比例不匹配时，会出现带现象。即抗体过量时，出现前带现象；抗原过量时，出现后带现象。本试验，是由于加入了过量的抗体，故出现了前带现象；③有研究报道未稀释或低倍稀释存在较高的非特异反应；单项乙肝病毒核心抗体阳性标本中存在低滴变和假阳性结果[6]。由于上述原因常常会导致假阳性的出现，使得阳性率明显增高。所以，加样方式3不适合用ELISA竞争抑制法检测乙肝病毒核心抗体标志物。

3.5当然，影响ELISA竞争抑制法的因素还有很多很多。在日常的实际操作中，除上述加样方式外，还有加样的间隔时间长短[7]、标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过间过长和标本凝固不完全、试剂盒的抗原不纯等等都可导致假阳性，影响实验室检测结果的准确性[8-9]。

因此，在ELISA法验测乙肝病毒核心抗体标志物时，若一般门诊及住院患者数量不是很大时建议采用加样方式1；遇有大规模普查或体检情况等大量标本时若采用加样方式1，其工作量太大，同时也增加了操作的繁琐性，建议采用加样方式2；原则上在ELISA法检测乙肝病毒核心抗体时，不采取加样方式3的方式。同时，我们在实际操作过程中，还应对标本进行严格处理，选择灵敏度高、特异性强的试剂和具有准确、稳定的酶标仪，开展室内质控等办法与举措，才能保证检验结果准确无误，更好地为患者及临床服务[10]。

[1] 张丽莉,蔡安.三种不同加样模式对ELISA法检测乙型肝炎核心抗体结果的影响[J].实验与检验医学,2010,28(6):645.

[2] 胡建平.不同加样方式对酶联免疫吸附试验检测抗-HBc的影响[J].临床误诊误治,2011,24(6):81-82.

[3] 梁修珍.6种不同加样量对酶联免疫测定法检测乙型肝炎病毒核心抗体结果的影响[J].国际检验医学杂志,2014,35(4):481-482.

[4] 邹映东,林云,张兴宗,等.不同稀释及洗板方式对竞争法检测乙肝核心抗体的影响[J].国际检验医学杂志,2013,34(12):1569-1570.

[5] 王兰兰,吴健民.临床免疫学与检验[M].4版.北京:人民卫生出版权社,2010:103-107.

[6] 李艳霞.ELISA法检测乙肝病毒抗-HBc和抗-HBe假阳性原因分析[J].中国当代医药:2010,17(36):82-84.

[7] 何瑛,吴人风.加样时差对竞争法抑制法检测抗-HBc的影响因素探讨[J].中国当代医药,2010,17(10):56-57.

[8] 杨京民.ELISA法对乙型肝炎“两对半”检测结果的影响因素的分析[J].国际检验医学杂志,2012,32(21):2551-2552.

[9] 丁文,薛庆欢,吴文金,等.人为操作因素对酶联免疫吸附法检测乙肝病毒血清标志物影响的探讨[J].中国实验诊断学,2010,14 (7):1019-1022.

[10] 薛春梅,邹建波.ELISA法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义[J].中国误诊学杂志,2011,11(16):3913-3914.

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1671-8194（2015）30-0145-02