两种提取冻存全血基因组DNA方法的比较

吕晓岩* 严 笠 刘 霞 肖 苒*

（中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京 100144）

两种提取冻存全血基因组DNA方法的比较

吕晓岩* 严 笠 刘 霞 肖 苒*

（中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京 100144）

目的 比较两种不同方法提取冻存全血中基因组DNA的效果和特点。方法 分别用改良碘化钾法和Promega全血基因组提取试剂盒提取全血基因组DNA，通过紫外分光光度仪、凝胶电泳、PCR进行检测。结果 改良碘化钾法和试剂盒法提取的基因组DNA浓度分别为（330.9±0.94）ng/μL和（490.3 ±3.16）ng/μL ；纯度为（1.87±0.03）和（1.85±0.06）。试剂盒法提取的基因组DNA含量稍高于改良碘化钾法，质量和纯度无显著差异。结论 试剂盒法更简便、快速、无毒地进行提取DNA，但价格较贵；改良碘化钾法价格低廉，适合大量临床血液标本的提取，能够满足分子生物学实验的需要。

基因组DNA；碘化钾法；改良法；外周血

人类基因组DNA是重要的遗传信息载体，其提取技术是分子生物学研究的基础，也是后续实验成功的关键。临床全血样本来源零散数量大，往往不能及时提取DNA，部分样本需低温冷冻保存。但反复冻融会影响DNA的产量，因此从冻存标本中提取高产量、高纯度的基因组DNA至关重要[1]。将碘化钾法加以改良并与Promega公司试剂盒法比较，分析两种方法提取基因组DNA的纯度和产量及后续实验效果。

表1　两种方法提取的基因组DNA各项指标比较（n =10）

图1　两种方法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

图2　两种方法提取基因组DNA的PCR琼脂糖凝胶电泳

1　材料与方法

1.1仪器和试剂：超微量紫外分光光度计（美国），凝胶成像系统（美国），高速离心机（日本），PCR仪（德国），漩涡混合器（国产）；Promega全血基因组DNA提取试剂盒，氯仿/异戊醇，碘化钾，氯化钠。

1.2方法

1.2.1样本收集：取-75 ℃冷冻保存的枸橼酸钠抗凝人外周血10份，2000 r/min 离心10 min，分离血浆和血细胞。血细胞分成两份，300 μL/份。

1.2.2DNA提取

1.2.2.1试剂盒法：按照Promega全血基因组提取试剂盒使用说明书提取基因组DNA。

1.2.2.2改良碘化钾法[7]：参考文献[2]加以改良，实验在4 ℃下操作：①300 μL抗凝血加1 mL 0.2% NaCl，混匀，室温静置10 min，12000 rpm，5 min，弃上清，沉淀为白细胞。若沉淀发红再处理1次。沉淀中加80 μL 5 mol/L KI裂解白细胞膜，漩涡振荡30 s；再依次加入0.9% NaCl溶液400 μL，氯仿/异戊醇（24∶1）混合液500 μL，振荡混合1 min后，12000 rpm，5 min，吸取水相层转移至1个1.5 mL离心管中。②加300 μL异丙醇沉淀DNA，12000 rpm，5 min，弃上清。③加1 mL70%乙醇洗涤沉淀2次，12000 rpm，1 min，弃上清待干，15 μL TE溶解DNA。

1.2.3DNA纯度和浓度检测：用紫外分光光度计测定基因组DNA的纯度，以A260/A280的比值[3]表示；双链DNA浓度（ng/μL）=OD260× 50（ng/μL）×稀释倍数。

1.2.4DNA完整性检测：两组分别取60ngDNA采用1%琼脂糖凝胶，100 V，40 min电泳，用凝胶成像系统观察结果检测其完整性，拍摄成像。

1.2.5体外PCR扩增：针对管家基因GAPDH进行扩增。上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGAC GCCAGTGGA-3'，反应体系20 μL，DNA含量200 ng，反应条件：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环。

1.2.6统计学分析：应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，采用独立样本t检验方法，结果以均值±标准差（mean±SD）表示，P＜0.05有统计学意义。

2　结 果

2.1DNA浓度和纯度检测结果：比较两种方法提取的的基因组DNA浓度和纯度，结果发现试剂盒法提取的DNA浓度、含量稍高于改良碘化钾法，经统计学分析，差异不明显，P＞0.05，见表1。

2.2DNA完整性检测结果：1%琼脂糖凝胶电泳，两组DNA条带均没有出现明显拖尾现象（图1）。

2.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳：将两种不同方法提取的基因组DNA分别扩增内参基因GAPDH，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，均可见清晰目的条带，扩增效果无差别。见图2。

3　讨 论

全血基因组DNA提取方法比较多，不同方法有各自的优缺点，如试剂盒法、氯仿/异戊醇法、异硫氰酸胍法、固相吸附法、盐析法和碘化物法等[4-6]。选择简便、快速、价格低廉、高效的方法是提取基因组DNA的重要条件。本试验用改良碘化钾法和Promega试剂盒法提取冻存全血基因组DNA，并对提取效果进行了比较。

在本实验中改良碘化钾法将血量由100μL增加到300μL，增加白细胞的数量而提高了DNA的产量；碘化钾的用量增加到80μL，可以在短时间内直接裂解白细胞膜、核膜，完全充分释放DNA[7]。Promega试剂盒提取的DNA产量虽稍高于改良碘化钾法，但无统计学意义，并且两种方法提取的DNA纯度都达到1.80以上水平，经琼脂糖凝胶电泳和PCR检测均可满足后续分子生物学实验的要求。但是试剂盒价格昂贵，对于冻存血样来说，处理血细胞需要更多的细胞裂解液，提高了实验成本，若提取大量临床血液标本将增加实验经费；改良碘化钾法配制简单，方法易于掌握，重复性好，所用的试剂为实验室常用的生化试剂价格低廉适合大批量临床血液标本的提取。

[1] 王大明,邹红岩,李桢,等.全血反复冻融对工作站提取基因组DNA的影响[J].现代检验医学杂志,2009,5(3):96-98.

[2] 吴清敏,刘巧红,滕云,等.外周血DNA提取方法的比较[J].中华检验医学杂志,2004,27(7):445-446.

[3] 田子强,刘俊峰,张少为,等.甲醛固定石蜡包埋组织中DNA的三种提取方法比较[J].基础医学与临床,2004,4(4):335-338.

[4] 白春英,周静,瑞云,等.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法[J].检验医学与临床,2010,9(7):1795.

[5] 李晓晓,赵焕英,杨云廷,等.三种人全血基因组DNA提取方法的比较[J].现代生物医学进展,2013,27 (13):5221-5225.

[6] 张帅,徐锐,张强,等.改良盐析法提取全血基因组DNA的影响因素研究[J].中国现代医学杂志,2012,22 (35):42-46.

[7] 蔡雪梅,李穗文,胡大春.改良碘化钾法提取冻存外周血基因组DNA的方法探讨[J].分子诊断于治疗杂志,2013,3(5):95-98.

Comparison of Two Methods for Extracting Genomic DNA from Human Whole Blood

LV Xiao-yan, YAN Li, LIU Xia, XIAO Ran
(Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China)

Objective To compare the effect and characteristics of genomic DNA extraction from frozen whole blood using two different methods. Methods Genomic DNA were extracted with potassium iodide method and Promega Genomic DNA Purification Kit.The detection was performed by UV spectrophotometry, gel electrophoresis and PCR. Results The concentration of genomic DNA extracted by potassium iodide method and Promega Genomic DNA Purification Kit method was： （330.9±0.94）ng/μL and （490.3±3.16）ng/μL； and the ratio of A260/A280 was： （1.87±0.03） and （1.85±0.06）.The quantity of genomic DNA extracted by kit is slightly higher than that by potassium iodide method. There is no significant difference in DNA quality and purity between two methods. Conclusion Kit is the more simple, faster, non-toxic method compared with the potassium iodide method, but the cost is expensive. Potassium iodide method is helpful to extract genomic DNA from a large number of clinical blood samples due to the low cost. Two methods are able to meet the needs of molecular biology experiments.

Genomic DNA; Potassium iodide method; Improved method; Peripheral blood

R446

B

1671-8194（2015）30-0016-02

E-mail：lxyan3699@163.com

*通讯作者：E-mail：rxiao163@163.com