RANTES在子宫内膜异位症大鼠模型中的作用研究

太原化学工业集团有限公司职工医院（030021）王贵英

子宫内膜异位症是子宫内膜出现在机体子宫腔以外的其他部位的一种疾病，高发于25～45岁女性，发病率约占育龄期妇女的10%～15%[1]。子宫内膜异位症的临床表现多种多样，主要症状为继发性痛经，并随疾病的进展而渐进性加重，严重影响妇女的身心健康。目前，临床上采用药物和手术两种方法治疗子宫内膜异位症。但迄今为止，除了切除子宫根治手术外，还没有一种理想治疗子宫内膜异位症的方法，无论是药物治疗还是保守性手术均有高达50%以上的复发率。因此，寻找治疗子宫内膜异位症安全、有效的方法是目前子宫内膜异位症研究的重点。

子宫内膜异位症的发病机制至今仍未完全阐明。自从1860年Von Rokitansky首次对子宫内膜异位症进行阐述后，众多关于子宫内膜异位症发病机制学说纷纷出现。1925年Sampson发表经血逆流学说[2]，提出脱落的子宫内膜碎片随经血逆流至腹腔后，发生种植，并在局部生长。问题是经血逆流是育龄期妇女一种常见生理现象，但是仅有约10%～15%的妇女患子宫内膜异位症。有学者表明[3]，内膜发生种植与生长要完成粘附、侵袭和血管形成三个步骤。由此可见，子宫内膜种植只是发病的原因之一，尚有其他发病机制在发病过程起作用。近年来，炎性反应在子宫内膜异位症发病机制中的作用成为众多学者的研究热点。RANTES是一种由正常T细胞表达和分泌的趋化因子，参与了大量的炎性反应过程。有研究报道，RANTES与内异症有着密切的关系，因此对RANTES的干预可能成为治疗子宫内膜异位症的新想法。PDTC是一种NF-ΚB抑制剂，它可以抑制炎性反应中的信号传导枢纽—NF-ΚB通路的表达，从而抑制子宫内膜异位症的发生、发展。本文将通过研究RANTES在大鼠子宫内膜异位症模型中的发达，及PDTC对其产生的作用，探讨RANTES在子宫内膜异位症发生发展中起到的作用。

附表1 干预前两组异位灶体积

附表2 干预4周、8周后两组内膜异位灶体积

附表3 干预后两组大鼠血清中RANTES浓度的比较

附图1 大鼠动情期显微镜成像

附图2 手术自体移植法造模过程

附图3 造模成功标准

1 动物模型的构建

1.1 实验动物 选取健康雌性SD大鼠50只，周龄8～10周，体重200～250g。给予标准光照周期，按需添加标准饲料和水，定期更换垫料保持鼠笼清洁干燥。室内温度保持20℃，湿度40%～50%。

1.2 SD大鼠动情期的确定 用无菌棉签插入大鼠阴道内，旋转棉拭子3～4圈，取出进行涂片，利用光学显微镜观察分泌物的细胞形态。大鼠动情期时可见大量无核角化细胞和少量上皮细胞。选择监测有连续3个动情期的大鼠进行造模。（见附图1）

1.3 大鼠内异症模型建立 给予大鼠1 0%的水合氯醛0.4ml/kg腹腔麻醉。麻妥后，将大鼠固定于动物实验台上。于尿道口上方1cm处打开腹腔。进入腹腔后，充分暴露子宫，取右侧子宫近端离右侧子宫角1cm处结扎，远端离卵巢1cm处结扎。剪下中间段子宫后，行子宫段断吻合术。分离离断的子宫内膜及肌层。将其修剪成一块约3mm×3mm大小的子宫内膜组织，将内膜面朝向腹腔，并固定在切口左侧腹壁处，以无损伤棉线固定。每只大鼠注射25万单位青霉素钠。查无出血后，用丝线分层缝合腹部切口。大鼠分笼安放，待其自然苏醒，常规喂养。术后连续3天给予肌肉注射青霉素钠，25万单位/只。保持鼠笼干燥清洁。（见附图2）

1.4 造模成功标准 肉眼可见移植物体积增大，呈小泡状的透明结节或囊肿，囊内可见黄色或透亮浆液，移植物有新生血管生成，被结缔组织覆盖。切取移植物送病检。病理诊断证实为子宫内膜异位症即造模成功。（见附图3）

2 实验方法

2.1 实验对象分组 将造模成功的40只大鼠采用随机分组的方法分为两组，分别为：对照组和PDTC组。计算內异灶体积=0.52×长×宽×高[4]（见附表1）。各组内异灶体积比较P＞0.05，差异具有统计学意义。测量后给予对照组常规饲养。PDTC组给予PDTC100mg/kg/d，持续8周。

2.2 取材 应用酒精棉球擦拭鼠尾。用5号头皮针穿刺大鼠尾部，抽出注射器活塞，制造负压进行取血。取血结束后，应用脱脂棉球按压针眼部位30s，确定止血后放开大鼠[5]。切取大鼠异位病灶阻滞，用生理盐水清洗，放入液氮保存。

2.3 ELISA方法测定血清中RANTES含量 所取大鼠尾静脉血置于无菌采血管中，放置1～2 小时后离心(1000 转/分钟)10min，吸取血清置于-2 0 ℃冰箱保存。选用RANTES ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）进行血清RANTES的测定。所有OD 值减除空白值后，根据标准品之OD 值在半对数纸上画出标准曲线，再根据样品的OD 值通过标准曲线计算出相应RANTES含量。

2.4 R T-P C R 方法测定大鼠异位灶中RANTES的含量

2.4.1 RNA引物的设计 根据GenBank NCBI发表的RANTES全长cDNA序列，采用Primer premier5.0软件设计大鼠RANTES引物。RANTES上游引物为：5′-CCATATGGCTCGGACACCA-3′，下游引物为5′-GCTCATCTCCAAATAGTTG-3'，扩增产物长度为2 2 1 b p。内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的上游引物为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，扩增产物长度为480bp。

2.4.2 实验步骤 取出标本，称重后加入1mlRNAiso Plus裂解细胞，充分裂解后转移至EP管，室温静置。5min后加入200μl三氯甲烷，充分震荡后室温静置。5min后在12000rpm，4℃条件下离心15min。吸取上清液转移至EP管，加入等体积异丙醇摇匀，室温静置10min，再次离心5min。吸取上层乙醇，注意不要触及RNA。干燥后加入DEPC水溶解RNA。

2.4.3 提取RNA纯度测定 取1μl以上步骤提取的RNA，加入99μlTBE，用分光光度计测OD260和OD280数值。提取RNA纯度= OD260/OD280。纯度在1.7～2.0表示转录要求。

2.4.4 PCR扩增 将提取RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。PCR扩增方案为：逆转录cDNA，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Dntp Mixture，2.0μl；TaKaRa Taq，0.25μl；上游引物，1.0μl；下游引物，1.0μl。用去离子水定容至25μl。

2.4.5 PCR产物电泳 取0.7g 2%琼脂糖凝胶，放入烧杯中，加入35ml 0.5×TBE缓冲液。在微波炉中加热至琼脂糖融化后取出，摇匀冷却，60℃时缓慢导入放有梳子的玻璃槽，注意不要有气泡的出现。静置30min后取出梳子。将凝好的琼脂凝胶放入电泳槽，加入0.5×TBS缓冲液直至没过凝胶表面。加入样品与DNA Marker，进行电泳。结束后，在EB溶液中染色，用紫外灯显像、拍摄。用光密度与GAPDH的作为半定量标准。

3 统计学方法实验结果采用SPSS13.0统计软件处理数据，数据均以均数±标准差的形式表示，多个独立样本两两均数之间的比较采用SNK-Q检验，P＜0.05，表明差异具有统计学意义。

4 结果

4.1 内异灶体积的变化 随着时间的延长，对照组内异灶体积逐渐增大，PDTC组内异灶体积逐渐缩小，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。PDTC组第4周、第8周的内异灶体积均明显小于对照组，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）见附表2。

4.2 用ELISA 法检测治疗后各组大鼠血清中RANTES的含量 对照组第8周血清RANTES含量明显高于第4周，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。PDTC组第8周血清RANTES含量明显低于第4周，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。PDTC组第4 周、第8周大鼠血清中RANTES的水平均明显低于对照组，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。（见附表3）

4.3 R T-P C R 方法测定大鼠异位灶中RANTES的含量 对照组第8周内异灶RANTES含量明显高于第4周，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。PDTC组第8周内异灶RANTES含量明显低于第4周，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。P D T C 组第4 周、第8 周大鼠内异灶中RANTES的水平均明显低于对照组，其差异具有显著统计学意义（P<0.05）。（见附图4）

5 讨论

子宫内膜异位症是一种妇科常见疾病，其独有的痛经、慢性盆腔痛以及导致的不孕，严重影响育龄期妇女的健康和生活质量。RANTES（regulated upon activation normal T expression and secretion）, 是一种由正常T细胞表达和分泌的趋化因子，1996年Oral等指出RANTES参与子宫内膜异位症的炎症反应[6]。本研究发现，大鼠的血清、内异灶中RANTES的含量明显增高。由此我们推断RANTES参与了子宫内膜异位症发生发展的病理过程。另外还发现，如果无药物的干预，血清和内异灶中RANTES浓度逐渐增加，预示着RANTES可能是反应该疾病严重程度的指标之一。因此，RANTES的测定很可能成为临床上子宫内膜异位症治疗、评估的一个新方向。

附图4 RT-PCR对异位灶中RANTES的测量结果

核因子ΚB(nuclear factor kappa—B，NF-ΚB)是一种多种细胞的核转录因子，其作为信号传导途径中的枢纽，参与了众多炎性反应过程。其中RANTES趋化因子既是NF-ΚB传导通路中的一员。本研究中发现，NF-ΚB抑制剂PDTC可以抑制大鼠内异症模型血清和內异灶中RANTES的含量。说明PDTC治疗大鼠内异灶模型有效，并且成功的干预了RANTES的表达分泌。

综上所述，RANTES参与了大鼠子宫内膜异位症的发生、发展。NF-ΚB抑制剂PDTC可以抑制子宫内膜异位灶的生长及血清、内异灶RANTES的分泌。具有可观的临床应用前景。