儿康合剂定性定量方法的研究

阳建军刘淑梅李洪贵阳之韵

（1 郴州市第一人民医院，湖南 郴州 423000；2 中山大学药学院，广东 广州 510006）

儿康合剂定性定量方法的研究

阳建军1刘淑梅1李洪贵1阳之韵2

（1 郴州市第一人民医院，湖南 郴州 423000；2 中山大学药学院，广东 广州 510006）

目的 建立儿康合剂的质量控制方法。方法 采用薄层色谱对方中君药黄芪和白术进行鉴别；采用高效液相色谱法对黄芪中的主要成分黄芪甲苷进行含量测定。高效液相色谱柱为Welch XtimateTM C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相为乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 mL/min；漂移管温度70 ℃；喷雾器温度36 ℃；增益10；气体压力40.0 psi。结果 黄芪和白术薄层色谱斑点分离清晰，专属性强。黄芪甲苷在0.3068～1.534 μg范围内呈现良好线性关系，r=0.9992，平均加样回收率为98.26%，RSD=0.47%（n=9）。结论 建立的定性定量方法简便准确，重复性好，可用于儿康合剂的质量控制。

儿康合剂；薄层色谱；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器

儿康合剂是郴州市第一人民医院院内制剂，主要由黄芪、白术、茯苓、木瓜、豆蔻、牡蛎、鸡内金等药物组成，有益气健脾，固表止汗的功效，在医院临床使用多年，主要用于小儿厌食，多汗，体虚易感等。目前儿康合剂质量标准比较简单，只有单一鉴别实验，没有量化标准，难以对其质量达到全面控制，为了有效控制药品的质量，笔者采用薄层色谱对儿康合剂中的君药黄芪和白术进行定性鉴别，用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量，提高和规范儿康合剂质量标准，为制剂生产、检验、使用提供科学、先进、可控质量依据，保证制剂安全、有效、稳定，给医院带来一定经济效益和社会效益。

1　材料与仪器

1.1材料：黄芪对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120974-200609）；黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111730-200604，供含量测定用）；白术对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120925-200407）；儿康合剂（郴州市第一人民医院自制，100毫升/瓶。批号：101113、110422、110915）；乙腈和甲醇为色谱纯，石油醚、氯仿、正丁醇、氨水、硫酸、正己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醇等其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

1.2仪器：AUW220D分析天平（日本岛津公司）；Waters e2695高效液相色谱仪；Waters 2424；GA-10B低噪音空气泵（北京中兴汇利科技发展有限公司）；YO-KO-ZX型紫外分析暗箱（武汉药科新技术公司）；薄层板：硅胶G10 cm×20 cm，10 cm×10 cm预制板（青岛海洋化工厂）；JAC-400型超声清洗器（济宁奥波超声有限公司）。

2　方法与结果

2.1薄层鉴别

2.1.1黄芪鉴别［1］：黄芪供试品溶液制备：取本品25 mL至具塞锥形瓶中，用水饱和正丁醇30 mL超声15 min，提取2次，合并正丁醇液置于分液漏斗中，用氨试液50 mL振摇洗涤1次，静置分层，分取上层正丁醇液、水浴蒸干，残渣加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为供试品溶液。黄芪对照药材溶液的制备：取黄芪对照药材2 g，同供试品法制成对照药材溶液。黄芪阴性样品液的制备：按儿康合剂的制备工艺制备缺黄芪药材的阴性制剂，按上述供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。同时称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL约含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照《中国药典》2010年版附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述四种液体各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰取出。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外光灯（365 nm）下显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，黄芪甲苷的Rf值为0.5（图1）。

2.1.2白术鉴别［2］：白术供试品液制备：取本品50 mL，用正己烷20 mL超声提取15 min，分离正己烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至1 mL容量瓶中，作为供试品溶液。白术阴性样品液制备：取按儿康合剂相同制备工艺制成的，不含白术药材的阴性制剂，用上述供试品液制备方法制成阴性样品溶液。同时称取白术对照药材0.5 g，加正己烷20 mL，按上述供试品液制备方法制成对照药材溶液。依据《中国药典》2010年版附录ⅥB照薄层色谱法，吸取上述三种液体各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（10∶1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外光灯（365 nm）下显相同颜色的荧光斑点，而阴性样品无干扰（图2）。

图1　黄芪TLC鉴别图

图2　白术TLC鉴别图

图3　样品HPLC色谱图

2.2含量测定［3-4］

2.2.1对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品16.42 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，作为浓度为1.642 mg/mL对照品储备溶液。

2.2.2供试品溶液的制备：精密量取本品25 mL，置具塞锥形瓶中，用水饱和正丁醇20 mL超声提取3次，每次20 min，合并正丁醇液置于分液漏斗中，用氨试液充分洗涤4次，每次15 mL，弃去氨液，再用水洗涤两次，每次15 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得样品供试液。

2.2.3阴性样品溶液的制备：除黄芪药材外，按照儿康合剂处方用量，取其他药材，模拟儿康合剂的制备方法，制成不含黄芪药材的阴性样品，按照“2.2.2”项下方法进行样品处理，制备阴性样品溶液备用。

2.2.4色谱条件及系统适用性实验：分别精密取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各20 μL，注入液相色谱仪，结果：供试品溶液与对照品溶液在相同的保留时间处有相同的色谱峰，阴性对照液与对照品溶液及供试品溶液在相同的保留时间处无相应的色谱峰，供试品溶液有效峰与杂质峰能分离较好，分离度为2.4，拖尾因子0.52，色谱柱为Welch XtimateTM C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相为乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 mL/min；漂移管温度70 ℃；喷雾器温度36 ℃；增益10；气体压力40.0 psi；检测器波长：203 nm；理论塔板数按黄芪甲苷峰计不得少于2000（图3）。

2.2.5线性关系的考察：分别精密吸取对照品储备液溶液0.2、0.3、0.6、1.0、2.0 mL至2 mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，得浓度为0.164、0.246、0.492、0.820、1.640 mg/mL的标准溶液，分别精密吸取上述标准溶液20 μL，按“2.2.4”项下方法测定其峰面积，以黄茂甲苷对照品浓度为横坐标X，峰面积积分值为纵坐标Y，进行线性回归，其回归方程Y=1.6982X+15.344，r=0.9992（n=5）。结果表明黄芪甲苷在0.328～3.280 μg进样范围内，其浓度的对数与峰面积的对数呈良好的线性关系（表1）。

表1　标准品浓度的对数与峰面积的对数

表2　3批儿康合剂黄芪甲苷含量测定结果及RSD值（n=3）

2.2.6精密度试验：精密吸取同一对照品溶液20 μL，重复进样5次，计算其峰面积RSD=0.63%（n=5），结果表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液20 μL，在0、1、3、5、8 h分别进样20 μL，计算峰面积RSD为0.56%（n=5）。结果表明供试品溶液峰面积在8 h内稳定。

2.2.8重复性试验：取同一批号101103儿康合剂样品5份，每份25 mL，按“2.2.2供试品溶液的制备法”项下方法分别制备供试品溶液，按2.2.4项下色谱条件测定5份供试品溶液的黄芪甲苷含量，结果黄芪甲苷平均含量0.0875 mg/mL，RSD=1.54%（n=5）。

2.2.9加样回收试验：精密吸取批号101103，已知含量为0.0875 mg/mL的儿康合剂样品9份，每份25 mL，三份为一组，每组分别精密加入浓度为0.492 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液3.50、4.50、5.50 mL，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定，计算回收率，结果平均加样回收率为99.73% ，RSD=1.17%（n=9）。说明此方法稳定可靠，可用于样品的含量测定。

2.2.103批样品含量的测定：取3个批号的儿康合剂（101103、110422、110915）按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，按照“2.2.4”项下色谱条件测定，计算3批样品中黄芪甲苷的含量。见表2。

3　讨 论

3.1薄层色谱条件的考察：在参照2010版《中国药典》一部有关黄芪和白术药材的色谱条件的基础上做了一些改进，黄芪定性鉴别的供试液制备中，用正丁醇超声提取15 min后，各成分的提取效果比直接用正丁醇振摇提取要完全，且干扰成分无明显影响，又可防止振摇过程中样品液乳化难以分层的现象，缩短了样品处理时间。另外，在本实验中，黄芪甲苷显色较慢，在显色过程中，需将用10%硫酸乙醇显色后的薄层板在105 ℃烘箱中加热5～8 min，斑点显色清晰，又不会板被烤焦。薄层板展开时，展距在8～12 cm时各斑点清晰分开，分离效果较佳。

白术制备供试液时考察了提取溶剂乙醚、石油醚和正己烷，结果正己烷的提取液斑点分离清晰，无拖尾现象，干扰成分少，因此选择正己烷作为提取溶剂。

通过对三批样品的检查，在本实验条件下，黄芪、白术各组分斑点显色清晰，分离较好，且阴性对照无干扰，专属性强，薄层色谱重现性较好，此方法可作为儿康合剂中黄芪和白术的定性鉴别。

3.2黄芪甲苷高效液相色谱条件的考察：对黄芪甲苷的提取分离方法进行了考察，本品超声提取3次，每次20 min之后，黄芪甲苷的含量已没有明显变化，因此无需再延长提取时间和次数。2010版《中国药典》黄芪药材中黄芪甲苷含量测定时，样品需要过D101型大孔吸附树脂柱处理，而本制剂，经过正丁醇提取和氨试液、水洗处理之后，其甲醇溶液用蒸发光散射检测器检测，高效液相色谱图已无杂质干扰，且色谱峰稳定，分离度等已均达到《药典》高效液相色谱法测定相关要求，因此，本品无需用D101型大孔吸附树脂柱处理。

实验中流动相的种类和流动相比例对各组分的色谱峰的分离度和出峰时间有一定影响，通过试验比较，最后确定采用乙腈∶水（32∶68），在此比例下，黄芪甲苷的峰型和分离度均较好，同时阴性样品无干扰。通过三批样品的重复测定结果（表2），表明本方法较简便、稳定、准确、重现性好，可以作为我院院内制剂儿康合剂黄芪甲苷的含量测定方法。

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2010：283.

［2］李耀荣，徐青青，莫玉芳.益气通鼻颗粒中白术鉴别方法探讨［J］.中国药业，2009，18（24）：32-33.

［3］陈荣，黄梦娴.HPLC法测定归茂补血口服液中黄苗甲昔的含量［J］.中国药师，2009，12（1）：77-79.

［4］刘秋鹤，付小六，马阁.高效液相色谱法测定复明口服液中黄芪甲苷的含量［J］.中国现代药物应用，2009，3（8）：24-25.

R282.71

B

1671-8194（2015）28-0041-03