抗耐药细菌药用植物内生菌的筛选与鉴定

刘晓瑜 马玉超

（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

抗耐药细菌药用植物内生菌的筛选与鉴定

刘晓瑜 马玉超

（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐头孢霉素大肠杆菌和耐亚胺培南铜绿假单胞菌在医院临床治疗中引起的严重感染，极大地危害着人类身体健康。旨在从植物组织中分离和筛选高活性的拮抗上述耐药细菌的内生菌株。从分离自22种药用植物组织的197株内生菌中，经过两步筛选获得18株对MRSA有拮抗作用的菌株，未筛选到对耐头孢霉素大肠杆菌和耐亚胺培南铜绿假单胞菌有拮抗作用的菌株；经16S rRNA序列分析，其中8株为链霉菌属，6株为芽孢杆菌属，4株为假单胞菌属；对抑菌效果较强的5株菌进行发酵培养，检测发酵液对MRSA的抑菌效果，其中QN1和CF2的发酵液对MRSA有很好的抑制效果。

植物内生菌；抑菌活性；耐药细菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

抗生素药物通常通过干预至关重要的代谢途径阻止或破坏致病性细菌的生长，治疗由细菌引起的传染性疾病［1］。大多数抗生素都有高目标的具体机制，通过干扰一个特定的细胞功能，如细胞壁合成、蛋白质或RNA合成、DNA复制或能量代谢等来发挥作用［2］。抗生素被广泛应用于人类和动物的疾病治疗，导致耐药病原菌株的增加。耐药病原菌产生的主要原因是这些菌株能够合成抵抗抗生素的物质，或在生物膜表面形成多糖和蛋白质的水合矩阵［1］，或通过遗传适应来克服易感性［4］等。

耐药菌感染已成为危害人类健康的严重问题［5］，特别是耐药性的革兰氏阴性杆菌，如耐头孢霉素大肠杆菌［6］、耐亚胺培南铜绿假单胞菌［7］和革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，在临床治疗中的检出率最高，它们引起的严重感染，是医院临床治疗的难点之一。每年有超过25 000个病人死于多重耐药细菌的感染，在医疗保健环境中，如医院或疗养院，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是引起血液感染、肺炎和手术部位感染的主要原因，其通过各种机制对传统的β-内酰胺类大环内酯类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素均表现出高度耐药性［8］，从而导致死亡率和住院费用的增加［9］。对头孢菌素、氟喹诺酮类耐药是以大肠杆菌为代表的肠杆菌科细菌的主要特征［6］。铜绿假单胞菌具有多重耐药机制，亚胺培南是大量使用的广谱抗菌药物，其耐药率逐渐上升，耐亚胺培南铜绿假单胞菌是医院中分离较多的较为常见的耐药细菌之一［7］。

近年来，由于世界范围内抗感染治疗领域中细菌耐药性问题越来越严峻以及新型感染性疾病的不断涌现，寻求和开发新的微生物资源，对新型抗生素的发现和耐药性感染性疾病的治疗具有重大的现实意义。随着土壤微生物资源的日趋枯竭，人们开始寻求新的微生物生境。微生物定殖在植物体内与其长期协同进化，使得植物内生菌形成了不同于土壤微生物的代谢途径，产生大量化学结构新颖、抑菌效果较好，或有特殊作用的生物活性物质［10］。从药用植物这样一个特殊的生态位中分离得到的内生菌，很有可能产生植物相关天然药物，如生物碱、甾体、萜类、醌类和木脂素等［11］，以利于开发新型抗生素和天然活性产物。本研究从不同环境采集的药用植物中分离得到数量繁多的内生菌，对其进行抗MRSA、耐头孢霉素大肠杆菌、耐亚胺培南铜绿假单胞菌的筛选，得到的拮抗菌株进行菌株鉴定，对抑菌效果强的菌株进行发酵培养，检测其发酵液抑菌活性，旨在为后续分离和提取对耐药细菌有抑制效果的抗生素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 22种药用植物材料：采集自湖南衡山的金钱松（Pseudolarix amabilis （Nelson）Rehd）、杜鹃（Rhododendron simsii Planch）、崖爬藤（Tetrastigma formosanum（Hemsl.）Gagnep.）、山 海棠（Begonia yunnanensis）、虎杖（Reynoutria japonica Houtt.）、南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）、菊叶三七（Gynura japonica）、蛇足石杉（Huperzia serrata（Thunb. ex Murray）Trev.）、野菊花（Dendranthema indicum（Linn.）Des Moul.）、钩腺大戟（Euphorbia sieboldiana）和苦木（Picrasma quassioides）；采集自北京药用植物园的紫苏（Perilla frutescens）、野花椒（Zanthoxylum simulans Hance）、 构 树（Broussonetia papyrifera）、薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）和粗榧（Cephalotaxus sinensis）；采集自北京林业大学校园的贴梗海棠（Chaenomeles speciosa ）、紫荆（Cercis chinensis）、牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）、暴马丁香（Syringa reticulata var. mandshurica）和君迁子（Diospyros lotus Linn.）；采集自鹫峰国家森林公园的荠苨（Adenophora trachelioides）。

1.1.2 供试菌株 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus T1959）、耐亚胺培南铜绿假单胞菌（I m i p e n e m- r e s is t a n t Pseudomonas aeruginosa F1 029）和耐三代头孢霉素大肠杆菌（Cephalosporin- r e s is t a n t Escherichia coli N800）均来自北京大学第三医院。

1.1.3 培养基 供试培养基为：（1）TWYE培养基［12］：酵母提取物0.25 g，K2HPO40.5 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2-7.4。（2）GA培养基：葡萄糖2 g，天门冬酰胺1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2-7.4。（3）ISP2培养基［13］：酵母提取物4 g，麦芽提取物10 g，葡糖糖4 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2-7.4。（4）LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.2。（5）MS培养基（链霉菌发酵培养基）［14］：大豆蛋白胨12 g，甘露醇20 g，CaCO32.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.2 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。（6）芽孢杆菌发酵培养基［15］：右旋葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH6.8。

1.1.4 主要试剂和仪器 革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒购自Bio-tek OMEGA，PCR扩增相关试剂购自大连宝生物工程有限公司，引物由Invitrogen公司合成，测序服务由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供。PCR仪和凝胶成像系统分别为Bio-Rad PCR仪和上海Tocan360凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 植物内生菌的分离 将植物组织样品室温风干48 h后，进行五步法表面消毒［14］，用组织块法和液氮研磨梯度离心法［16］将植物组织和悬浮液放置在GA和TWYE 两种分离培养基上，28℃恒温培养3-6周。挑取不同形态菌落在ISP2培养基上纯化，然后通过菌落和显微镜下菌丝体特征，剔除相同的菌株。纯化后的菌株用15%的甘油，-80℃保存。

1.2.2 拮抗内生菌的筛选 挑取3种指示菌单菌落分别接种于液体LB培养基中，180 r/min、28℃震荡培养过夜。以100 mL培养基中加入100 μL菌液的比例，向融化后冷却至40℃的LB培养基中加入指示菌菌液，充分摇匀后倒平板，待培养基冷却凝固后，每个平板接种8个内生菌，放入28℃恒温培养箱中观察内生菌对每种指示菌的抑制情况。若内生菌周围出现透明的抑菌圈，说明此内生菌对该指示菌有抑制效果。

对初筛获得的内生菌用划线法再进行一次抑菌活性检测，以便观察记录抑菌效果强弱。用划线法分别在LB培养基平板的两边接种两种内生菌，做好标记，放入28℃恒温培养箱中培养2 d，待内生菌长出，在平板中间空白处分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，划线要尽量接近两侧的内生菌菌落，划好线后置于28℃恒温培养箱中培养，随时观察培养基内指示菌生长情况。若指示菌在接近内生菌的区域内未长出菌落，说明该内生菌对此指示菌有抑制作用，抑菌效果强弱以抑菌带（未长出指示菌的区域）大小表示，抑菌带＞8 mm表示抑菌效果强，抑菌带5-8 mm表示抑菌效果中等，抑菌带2-5 mm表示抑菌效果弱。

1.2.3 拮抗菌株鉴定 采用16S rRNA基因的PCR扩增和测序分析法对筛选获得的拮抗内生菌进行菌种鉴定。以拮抗菌株的基因组DNA为模板，27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和1492r（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）［17］为引物进行50 μL反应体系的PCR扩增。体系中包含0.25 mmol/L dNTPs，1×Buffer，上下游引物各1 μmol/L，1.25 U的rTaq酶，5-100 ng的DNA模板。扩增条件：94℃变性4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃2 min，循环30次；72℃ 10 min。扩增产物送至诺赛公司测序后，用DNAMAN软件进行拼接，得到的序列提交到http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/［18］进行序列分析，然后用MEGA5.0软件［19］中的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树［20］。

1.2.4 拮抗菌发酵液活性检测 对筛选得到的抑菌效果强的菌株进行发酵培养，检测其发酵液活性。挑取拮抗菌单菌落于ISP1液体培养基中28℃恒温震荡培养2 d，获得种子液。以5%的比例加到100 mL/500 mL的1.1.3中所述相应发酵培养基中，28℃恒温震荡培养5 d。将金黄色葡萄球菌以1.2.2的方法混匀倒板，用打孔法检测发酵产物抑菌活性。发酵液10 000×g 4℃离心2 min后，取上清用0.22 μm的无菌滤膜过滤除菌。用5 mm打孔器打孔，加入60 μL内生菌发酵液，以未接菌的液体培养基做对照。置于28℃恒温培养箱中培养1 d，观察抑菌效果。若有抑菌效果，用直尺测量3孔培养基上每个孔的抑菌圈直径，取平均值计算抑菌圈大小。

2 结果

2.1 内生菌的分离

从22种药用植物中共分离得到197株内生菌，其中从杜鹃中分离得到22株、虎杖中分离得到18株、金钱松中分离得到16株、野菊花中分离得到14株，这4种植物分离得到的内生菌数量最多（表1）。在完全相同的分离条件下，不同的药用植物材料分离得到的内生菌数量不同，这与植物体内定殖的内生菌种类和分离得到内生菌的难易程度有关。与其他植物相比，从君迁子、紫荆和荠苨中只分离得到少数内生菌，推测可能试验所用的分离方法不太适宜这些植物，使得部分内生菌未释放出来。

2.2 拮抗菌株筛选

本试验用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐亚胺培南铜绿假单胞菌和耐三代头孢霉素大肠杆菌对分离得到的197株植物内生菌进行抑菌活性筛选，得到18株对金黄色葡萄球菌有抑制效果的内生菌（图1-A，图1-B），没有筛选到对铜绿假单胞菌和大肠杆菌有效果的菌株，这些拮抗内生菌分别来自13种不同的药用植物，其中以构树、牡丹、粗榧和蛇足石杉中得到的拮抗菌居多。

用平板对峙试验检测初筛获得的18株内生菌的抑菌活性，以耐药性金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌为指示菌，检测每种内生菌的抑菌活性强弱（图1-C）。获得试验结果统计（表2）显示，其中有7株对MRSA有较强抑制效果，5株抑制效果中等，6株抑制效果较弱。

表1 197株植物内生菌的统计结果

图1 内生菌对耐药细菌的抑菌效果

表2 18株内生菌对MRSA的拮抗活性

2.3 菌株鉴定

用Omega试剂盒提取18株拮抗菌的DNA，用16S rRNA 基因的通用引物进行PCR扩增，扩增产物送样测序，将所测序列拼接后提交到http：// eztaxon-e.ezbiocloud.net/进行同源性比对分析，用MEGA5.0软件构建系统发育树。对18株拮抗菌进行种属鉴定，其中8株为链霉菌属，6株为芽孢杆菌属，4株为假单胞菌属（表3，图2）。

2.4 发酵液活性检测

从中选出5株抑制效果较强的菌株（QN1、CF2、MD1、GS9和SZSS7）进行发酵液抑菌活性检测，仅有QN1和CF2菌株发酵液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有抑菌活性，抑菌直径分别为2.8 cm（图1-D）和2.1 cm。另外3个菌株的发酵液未检测到活性，可能是发酵液中活性物质的浓度过低或发酵条件不适宜，有待进一步深入研究。

表3 菌株鉴定结果

3 讨论

抗生素类药物在临床上的广泛使用导致许多致病菌对抗生素类药物产生了多重耐药性，特别是耐药性的革兰氏阴性杆菌，如耐头孢霉素大肠杆菌、耐亚胺培南铜绿假单胞菌和革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的严重感染，是医院临床治疗的难点之一，极大地危害着人类的健康［21］。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌于1961年首次在英国发现。50多年来，它在临床的检出率越来越高。万古霉素被公认为是目前最有效的抗生素，但耐万古霉素的金黄色葡萄球菌也于1997年在日本临床分离出来［22］。随着耐药菌株的逐渐增多及其耐药性的不断增强，现有抗生素的临床治疗效果受到了严重的限制，寻找和开发新型抗生素资源势在必行。

植物内生菌因其能产生多种具有生物活性的次级代谢产物，如抗生素、抗肿瘤物质、抗感染活性物质、植物生长促进剂和一些酶类而被广大研究者作为筛选新型活性物质的菌株。本研究从湖南衡山和北京郊区采集的22种药用植物中分离得到197株内生菌，从紫苏、野花椒、钩腺大戟和岩爬藤这4种植物中分离得到的内生菌目前尚未有文献报道，这些内生菌大大丰富了内生菌资源，可以进一步进行多样性分析并作为其他功能筛选的菌株资源。

16S rRNA序列分析显示，筛选得到的18株拮抗菌主要为链霉菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属，这3个属的菌株具有很强的抑菌活性，在许多文献中均有报道。菌株鉴定结果显示，很多拮抗内生菌是同一属内菌株，但由于分离植物的不同，产生的次级代谢产物很有可能不尽相同，还需要进一步研究。

目前，对于MRSA的治疗主要依赖于有机大分子消毒剂Akacid、带电金属有机聚合物和传统抗生素生物结合来发挥作用。Akacid是高度有效的全新消毒杀菌物质，能有效杀灭细菌、病毒、真菌等有害微生物，并且无毒副作用［23］；带电金属有机聚合物表现出协同效应能够抑制MRSA的β-内酰胺酶活性，同时降解细菌细胞［24］。张守村等［25］在新疆苦豆子Sophora alopecuroides中筛选到一株抗MRSA的内生细菌黏质沙雷氏菌Serratia marcescens，而本试验从多种药用植物中筛选得到抗MRSA的链霉菌和芽孢杆菌，为筛选新型抗MRSA的活性物质提供了丰富的菌种资源。

在检测发酵液抑菌活性试验中只有QN1和CF2菌株对MRSA有抑菌活性，另外3个菌株的发酵液未检测到活性，可以再设计不同的发酵条件，使其他菌株将抑菌活性物质释放出来。试验后期将进行抑菌活性物质的大量发酵和分离纯化，从而分析其组成成分和化学结构，并检测其在不同pH、不同温度、紫外线照射等环境下的稳定性。将纯化出来的抑菌活性物质与现用治疗MRSA药物进行分析，比较二者的强弱关系。同时可以寻找和研究控制抑菌活性物质表达的基因［26，27］，以便通过基因工程手段大量合成。对获得的产物进一步进行毒性检测，研究是否会对动植物造成损害，为新型药物的开发奠定基础。

4 结论

本试验从22种药用植物中分离得到197株内生菌，采用平板对峙试验筛选得到18株对MRSA有拮抗作用的菌株，未筛选到对耐头孢霉素大肠杆菌和耐亚胺培南铜绿假单胞菌有拮抗作用的菌株。经16S rRNA序列分析，其中8株为链霉菌属，6株为芽孢杆菌属，4株为假单胞菌属。选取抑菌效果强的5株菌进行发酵培养，其中QN1和CF2的发酵液对MRSA有很好的抑制效果。

图2 内生拮抗菌与相关菌的系统发育树

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（责任编辑 马鑫）

Screening and Identification of Antagonistic Endophytes Against Drug-resistant Bacteria from Medicinal Plants

Liu Xiaoyu Ma Yuchao
（College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）， Cephalosporin- r e s is t a n t Escherichia coli and I m i p e n e m- r e s is t a n t Pseudomonas aeruginosa have caused severe infection in clinical therapy and greatly endanger human health. The aim of this study is to isolate and screen highly active antagonistic endophytes against drug-resistant bacteria from medicinal plant. After two-step screening， 18 strains have antagonistic effect on MRSA were obtained from 197 strains isolated from 22 medicinal plants， none of the strains has antagonistic effect on Cephalosporin- r e s is t a n t Escherichia coli and I m i p e n e m- r e s is t a n t Pseudomonas aeruginosa；16S rRNA sequence analysis showed that eight strains belong to Streptomyces， six strains belong to Bacillus， and four strains belong to Pseudomonas. Five strains which have strong anti bacterial activity were chosen for fermentation， and the fermented liquid of QN1 have strong inhibition effect on MRSA.

endophytes；antibacterial activity；drug-resistant bacteria；Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.022

2014-08-31

国家林业局公益项目（201304409），北京市科技新星项目（2011033），国家自然科学基金项目（J1103516）

刘晓瑜，女，硕士研究生，研究方向：植物内生菌的抑菌活性研究；E-mail：liu.xiaoyu1991@163.com

马玉超，女，博士，副教授，研究方向：微生物资源开发利用；E-mail：mayuchao@bjfu.edu.cn