一株丁二酸高产菌株的筛选与选育

王乐 宇光海 杨硕晔 王为为 惠明

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

一株丁二酸高产菌株的筛选与选育

王乐 宇光海 杨硕晔 王为为 惠明

（河南工业大学生物工程学院，郑州 450001）

旨在提高丁二酸发酵生产水平，通过初筛、复筛从土壤中分离得到了高产丁二酸菌株，发酵结束后利用高效液相色谱法检测丁二酸的产率为34.45%。对菌株进行紫外诱变选育，结果表明，在底物葡萄糖的浓度为100 g/L时，丁二酸的产率提高了46%，达到了50.30%，残糖低于10 g/L。经形态学特征、生理生化指标测定以及16S rDNA序列分析等，鉴定该菌株为放线杆菌。

丁二酸；高产菌株；筛选；诱变；放线杆菌

近年来，丁二酸应用的领域不断拓展，国际市场的需求量也迅猛增加［1］。工业上生产丁二酸的方法主要为化学方法，常见的化学合成的方法有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯的氰化水解法、加氢法等，生产工艺相对成熟［2，3］。但化学法生产丁二酸的价格较高，且会消耗大量石油等不可再生资源，不利于资源的可持续发展，同时在生产过程中还会造成环境的污染［4，5］。微生物发酵法制备丁二酸具备诸多优势，如由于菌种特性及微生物酶的专一性，丁二酸纯度高且产品易分离；生物法生产丁二酸工艺与传统化学法相比，生产过程简化且成本低、生产条件温和且耗能小、生产工艺安全且对环境友好，因此生物法生产丁二酸已成为目前诸多学者研究的热点［6］。丁二酸的生物法生产主要有两种方式，葡萄糖经糖酵解转化为磷酸烯醇式丙酮酸后，一方面继续以三羧酸循环顺式的方式（丙酮酸→乙酰-CoA→柠檬酸→丁二酸）生成丁二酸，另一方面以三羧酸循环反式途径（苹果酸→延胡索酸→丁二酸）生成丁二酸［7，8］。其中，丁二酸代谢产生还需要受到CO2、丙酮酸羧化酶、柠檬酸合成酶等条件的调节［9，10］。目前，能够产丁二酸的菌种主要有黑曲霉、谷氨酸棒状杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌和重组大肠杆菌等［11］。

研究发现，放线杆菌l30Z菌株和它的变异株具有1-8 g/L氟乙酸盐的耐受力，可以生产大量的丁二酸［12］。产琥珀酸放线杆菌ATCC55618也是国内丁二酸发酵研究较多的菌株，研究发现其丁二酸产量为11.49 g/L，并有乳酸、甲酸和乙酸等副产物的生成［13］。近年来，研究人员筛选出菌株琥珀酸放线杆菌CGMCC1593，对其诱变选育后，在5 L发酵罐上发酵36 h，丁二酸产量高达40.51 g/L，同时伴随一些副产物［14］。天然的菌种产丁二酸的能力较低，副产物也较多，且对于底物或产物的耐受性较差，因此利用生物工程技术手段对现有的菌种进行改造成为该领域的研究重点［15］。为了降低乳酸、甲酸等副产物的生成，以野生型大肠杆菌w1485为出发菌株，在染色体中插入抗性基因，构建丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）和乳酸脱氢酶（ldhA）基因失活菌株，实现了丁二酸的高效生产［16，17］。美国MBI的专利中有丁二酸发酵的最高产量110 g/L，而产琥珀酸放线杆菌是目前丁二酸发酵最具工业化潜力的菌株［18］。

丁二酸作为一种优秀的化学平台产品，其前景广阔［19］。生物法生产丁二酸是基于可再生能源（如葡萄糖）和二氧化碳为主要原料，不仅能够摆脱对石油化工原料的依赖性，而且开辟了温室气体二氧化碳新的利用方式，具有可再生性、成本低廉、绿色无污染和环境友好等优势［9，20］。本研究旨在通过筛选、分离土壤中生产丁二酸的菌种，以得到一种可以在较为苛刻条件下生长，且属于微厌氧菌株，高产丁二酸的菌株，并对筛选出的高产菌株进行紫外诱变处理，以期有效提高丁二酸的产率和底物葡萄糖的利用能力，为后续试验进行菌种性能和生产工艺的改良，以及代谢控制发酵产丁二酸的研究奠定基础，也为大规模利用生物法生产丁二酸提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钙、碳酸镁、硫酸铵、氯化镁，均为分析纯，购于北京化工厂。莫能菌素、富马酸钠、溴甲酚绿、琼脂，均为生化级，均购于Sigma 公司。

1.1.2 仪器与设备 THZ-312型台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司），LDZX-0KBS型立式高温蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），SW-CJ-ZF型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司），722N紫外分光光度计（上海精科科学仪器有限公司），FA12004B电子天平（上海精科科学仪器有限公司），TDL-5-A离心机（上海安亭科技股份有限公司），Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.1.3 培养基及培养条件 富集培养基：葡萄糖40 g，富马酸钠5 g，酵母膏5 g，莫能菌素0.1 g，KH2PO43 g，NaCl 1 g，（NH4）2SO41 g，CaCl20.5 g，MgCl20.5 g，MgCO35 g，蒸馏水1 L，121℃灭菌15 min。

分离培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，NaCl 5 g，澳甲酚绿0.1 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH6.8-7.2，121℃灭菌15 min。

保藏培养基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g，K2HPO43 g，NaCl 0.1 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH7.0，121℃，灭菌15 min。

活化培养基：蛋白胨20 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 L，pH7.2±0.2。121℃，灭菌15 min。

种子培养基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g，K2HPO43 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.5 g，MgCl20.5g，pH7.0，121℃，灭菌15 min。

发酵培养基：葡萄糖100 g，酵母膏15 g，NaCl 0.5 g，NaHCO315 g，Na2HPO40.5 g，NaH2PO49.6 g，K2HPO45 g，pH7.0，121℃，灭菌15 min。

普通培养条件：接种量为10%，装液量为100 mL培养基/250 mL摇瓶，培养温度为37℃，pH值自然，转速150 r/min，摇瓶在灭菌过程中用纱布封口，接种后在纱布上覆盖保鲜膜以实现微氧环境，发酵周期72 h。

1.1.4 菌种 土壤样品采自郑州市某奶牛场。在郑州市某奶牛场，采集带有牛粪土壤和附近土壤共10处，每处各15 g，装入无菌袋中。将这10份采集回来的土壤样品放置在-20℃冰箱保藏，待用。

1.2 方法

1.2.1 土壤的富集培养 取10份保藏的土壤样品各3 g，分别放入250 mL摇瓶中含有150 mL的富集培养基中，于37℃培养24 h，之后按照15%的接种量，在同样的培养条件进行转接，共转接3次。培养结束后进行5 000 r/min离心3 min，弃上清，得到无菌湿菌体，待用。

1.2.2 纯菌种的分离 取土壤富集培养得到的湿菌体，适当稀释后分别涂布于溴甲酚绿变色分离平板，于37℃培养箱中培养32 h，取溴甲酚绿变色平板上变色菌落，用划线法接种到保藏培养基平板上培养，得到菌落，再用描点法接种到溴甲酚绿变色平板上，在发生变色反应的位置上得到菌落。重复上述过程直至不再出现杂菌。将分离得到单菌落接种于保藏培养基斜面上，保藏，用于菌株的筛选和发酵。

1.2.3 荧光法初筛检测 从斜面上取下少量分离得到的单菌落接入至种子培养基中，培养24 h后接入发酵培养基中，培养72 h，结束后进行5 000 r/min离心3 min，得上清发酵液，作为检测样品。取0.3 mL样品分别于试管中，加入浓硫酸0.3 mL，然后加入间苯二酚0.6 g后混合，将混合物沸水浴加热溶解直至有深红色出现，之后放入冰水混合物中冰浴10 min，然后从反应试管的边缘缓慢加入1 mol/L的NaoH溶液2 mL，震荡充分至反应物溶解，再缓慢加入5 mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液，观察颜色反应，是否出现绿色荧光圈，并判断荧光圈大小。

1.2.4 葡萄糖含量的测定 样品中葡萄糖含量的测定方法采用DNS法［21］。葡萄糖含量的标准曲线如图1所示。

图1 DNS法测定葡萄糖含量的标准曲线

1.2.5 高效液相色谱法复筛 进行菌株复筛的发酵样品，其丁二酸含量的测定采用高效液相色谱法。丁二酸含量的标准曲线如图2所示。

图2 高效液相法测定丁二酸含量的标准曲线

1.2.6 菌体干重测定 发酵结束后取20 mL菌体悬液于称重后的干燥离心管内，进行5 000 r/min离心5 min，去上清，菌体用无菌去离子水洗涤，离心，重复两遍后得湿菌体，于55℃烘干至恒重后称重。直接称重。

1.2.7 紫外诱变选育 将菌株在保藏培养基平板上活化12 h，接入种子培养基中，37℃培养24 h，得到菌体总体处在生长对数期的菌悬液，倒入无菌平皿中，深度约1.0 cm，菌体数量约为105个/mL，借助磁力搅拌器保持平皿中的菌悬液匀质。选取260 nm下的紫外光源，紫外灯的功率为15 W，灯源与菌悬液的最近距离为25 cm，进行紫外诱变。从打开紫外灯后计时，紫外线照射时间为5-120 s。紫外诱变结束后，将菌悬液均匀涂布在溴甲酚绿变色分离上，于37℃，避光培养2-3 d后得到出现变色反应的单菌落，在保藏培养基上延续传8代稳定后，重复荧光法初筛检测和高效液相法复筛，筛选经过诱变选育后丁二酸产量最高的优势菌株，并对发酵液中的菌体进行镜检。

1.2.8 菌株的生理生化试验 将紫外诱变选育得到的高产菌株接种于葡萄糖、木糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、纤维二糖、棉籽糖、淀粉、蜜二糖、硝酸盐、尿素、明胶等生化管内进行发酵试验，并进行革兰氏染色试验，根据结果判断其基本特性［22］。

1.2.9 16S rDNA的 PCR扩增及其序列分析 利用Oligo6 和Primer5.0软件设计一对通用引物，即上游P1：5'-AGAGTTTGATC（A/C）TGG-3'和下游P2：5'-GGACTAC（A/T/C）AGGGTATCTAAT-3'，P1和P2扩增出的片段大小约为780 bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

PCR扩增反应体系（25 μL）：10×Taq酶缓冲液 2.5 μL，引物 0.2 μmol/L，200 mmol/L dNTP 2 μL，DNA模板20 ng，Taq酶（TaKaRa）1 U，ddH2O 17 μL。PCR反应扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃复性1 min，72℃延伸2 min，循环30次；72℃延伸5 min。回收的目的片段，在目的片段大小处出现了特异性条带，且与预计的片段大小相符。测序工作由上海生工生物技术有限公司完成。

2 结果

2.1 富集培养分离菌株

采用含溴甲酚绿指示剂的琼脂培养基作为选择性平板，以稀释分离纯菌落为目的，对产丁二酸菌株进行富集培养。图3显示，在溴甲酚绿筛选平板上有一定量的单菌落生成，由于溴甲酚绿在酸性条件下会显黄色，因此，此变色菌落为产酸菌落。通过挑选溴甲酚绿选择性平板上不同变色菌落，尤其是对变色反应后出现较深色斑的菌株，进行选择性平板重复筛选，分离选取出优势菌株X1、X2、X3……Xn，分别进行斜面保藏。

图3 溴甲酚绿筛选平板上的菌落

2.2 荧光法筛选丁二酸生产菌株

荧光法筛选丁二酸生产菌株的结果（图4）显示，丁二酸标准品（1号）有着明显的绿色荧光圈，说明荧光法对丁二酸具有良好的显色分辨效果。2、3、4号样品为溴甲酚绿选择性平板变色的3株优势菌株X4、X7和X12。通过对比可知，3号（X7）和4号（X12）样品比2号（X4）样品的荧光显色结果更为清晰、明显，且荧光圈较大。因此将X7和X12菌株分别命名为Y3和Y4，作为利用高效液相法进行复筛的优势菌株。

图4 培养液样品的荧光法初筛

2.3 高效液相色谱法筛选丁二酸生产菌株

丁二酸标准品在高效液相法检测时的峰保留时间为4.22 min，两株菌在4.22 min时都出现有明显的色谱峰，说明Y3和Y4菌株均具有产丁二酸的能力，这也与荧光圈初筛的结果相一致。高效液相色谱检测丁二酸的方法经优化调整，条件如下：XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm）；流动相25 mmol/L K2HPO4，pH2.8（H3PO4调节）；流速0.8 mL/min；紫外检测器，210 nm；进样量，20 μL；柱温，室温。通过对比两株菌的高效液相色谱（图5和图6）表明，Y3菌株在底物葡萄糖浓度为100 g/L的发酵培养条件下，丁二酸的产率为34.45 g/L，利用DNS法测得的残留葡萄糖浓度为15.3 g/L。Y4菌株在底物葡萄糖浓度为100 g/L的发酵培养条件下，丁二酸产率为12.78 g/L，残留葡萄糖浓度为19.0 g/L。相对于Y4菌株，Y3菌株的发酵样品中丁二酸产量较高，且副产物较少，优势明显。Y4菌株的发酵生产丁二酸的能力一般，且有一些副产物的生成，可能是该菌株不仅生产出丁二酸还产出了如乳酸、甲酸等副产物，在一定程度上削弱了丁二酸代谢途径，降低了丁二酸的产量。因此，将利用高效液相复筛法得到的优势菌株Y3命名为G3。对G3进行紫外线诱变选育处理，以进一步提高该菌株的丁二酸发酵水平。

2.4 紫外线诱变

对G3进行紫外线诱变选育处理的致死率曲线（图7）显示，最佳的致死率时间为50-60 s，因此选择紫外照射的时间为60 s，采用平皿法，于30℃，避光培养2-3 d后，得到单菌落，在富集培养基上延续传8代稳定后，进行摇瓶发酵培养，并利用高效液相法进行丁二酸产量的检测，发酵菌体进行显微镜镜检。

图5 Y3菌株发酵液的高效液相色谱图

图6 Y4菌株发酵液的高效液相色谱图

图7 紫外线诱变菌体致死率曲线

紫外照射60 s的6株诱变选育结果与复筛优势菌株G3（空白对比）的结果（图8）显示，经过紫外诱变60 s后的1号菌株的丁二酸发酵结果有了明显提高，发酵培养结束后丁二酸产量最高，为50.3 g/L，相比于初始菌株的丁二酸产量34.5 g/L，提升了46%。1号诱变菌株的细胞干重为12.8 g/L，相比于初始菌株的细胞干重11.5 g/L，提高了11.2%。因此，将紫外诱变处理后丁二酸产量最高的1号菌株命名为Z1。

图8 紫外诱变60 s后的选育结果

2.5 Z1菌株的生理生化试验及分子鉴定结果

2.5.1 形态学特征及生理生化指标测定 优势诱变菌株Z1，在保藏培养基上培养2-3 d后形成直径约1 mm的菌落，菌落呈圆形凸起，表面光滑，不透明，边缘整齐，淡黄色。在显微镜下观察菌体大小（0.4-0.6 μm×1.0-3.5 μm），以杆形为主，无荚膜和动力。采用发酵培养基进行液体发酵培养，培养液均匀混浊，底部有菌体沉淀，经革兰氏染色呈现阴性。Z1菌株能够利用葡萄糖、木糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、纤维二糖、棉籽糖、淀粉，能够使硝酸盐还原，不能利用蜜二糖，无法使尿素分解、明胶液化。

2.5.2 16S rDNA的基因序列测定及比对结果 对Z1菌株16S rDNA的PCR扩增纯化产物进行序列测定，结果如图9所示，其序列经 BLAST 软件对比GenBank数据库，进行同源性分析得出，Z1与GenBank中序列号为|AF024525.1|的Actinobacillus succinogenes 16S rRNA基因同源性达到99%。综上可初步判断Z1菌株为放线杆菌。

图9 Z1菌株16S rDNA的基因序列测定结果

3 讨论

琥珀酸作为许多重要化学品的直接或间接合成中间体被广泛应用于化工领域，具有很高的商业价值和广阔的应用前景［23，24］。目前生产琥珀酸的方法主要有化学合成法和生物发酵法两种，但由于化学合成法具有能耗高，污染大等缺点，不符合可持续发展的要求［25］。近几年随着生物工程技术的迅速发展和逐渐成熟，生物发酵法生产琥珀酸因兼具资源可再生利用及吸收CO2等优势，具有广阔的发展潜力［24］。

从已报道的丁二酸生产菌株的种属分布来看，它们广泛分布于不同的种属中。目前主要生产丁二酸的菌种有黑曲霉、谷氨酸棒状杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌和重组大肠杆菌等［5］。对于从自然界中分离出产丁二酸菌种的研究，国内外已有很多报道，大多数的菌种自然产丁二酸的量还比较低，但是经过基因技术的改良能够有效地提高菌种的产量［23］。

据统计，自然界中生产丁二酸的菌属以放线杆菌居多，产琥珀酸放线杆菌具有高耐受底物浓度和产物抑制等优点，是最具有工业化发展前景的潜力菌株之一［25］。本研究分离得到的高产菌株也属于放线杆菌，但是与其他研究不同的是，本研究获得的优势菌株Z1对氧气的抵抗能力较强，能够在微厌氧条件下较好地生产丁二酸。原因或许是我们在对该菌株进行分离和选育时，有针对性的混杂一些无菌空气，筛选出的菌株能够较好地适应微厌氧条件，也或许与在紫外诱变选育的过程中发生了基因突变有关，有待于进一步深入的研究。

在富集培养过程中，培养基中加入了5 g/L的富马酸钠和0.1 g/L的莫能菌素，目的是促进目的菌株优势生长。富马酸是三羧酸循环中重要的电子受体，能转移氢，氢的减少能使产乳酸菌和产甲烷菌减少生长，在一定程度上避免一些产酸菌落的干扰［7］，为生产丁二酸菌种的筛选奠定了一定基础。采用荧光光圈筛选丁二酸生产菌株，该方法较为简便、经济、耗时比较少，适合于大量筛选产丁二酸菌株的工作［13］。荧光法筛选产丁二酸菌株的原理是：在浓硫酸存在的条件下，丁二酸首先形成丁二酸酐，丁二酸酐与间苯二酚缩合而成丁二酰荧光素，反应化学方程式如图10所示［12］。

图10 丁二酸酐与间苯二酚缩合成丁二酰荧光素化学方程式［12］

发酵液中丁二酸的含量与荧光圈的大小成正比，通过对比荧光显色状况和光圈大小，可以初步判断在同样培养条件下菌株的发酵产酸能力［13］。采用高效液相色谱法对经过荧光圈初筛法得到优势菌株进行复筛验证，能够检测菌株发酵生产丁二酸的水平，也能测定出该菌株在丁二酸发酵生产过程中的副产物生成情况。结果证实，实验室筛选得到的优势菌株在丁二酸发酵生产过程中，副产物代谢生成途径较弱，发酵液中的丁二酸含量较高，因此在后期的分离纯化的难度得以大幅降低，具有较强的竞争力。

目前所报道的琥珀酸产量最高的菌株就是琥珀酸放线杆菌的诱变突变株［24］，因此，本研究对筛选出优势菌株G3进行了紫外线诱变选育。紫外诱变的主要原理是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，以阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA能被可见光复活，故经紫外线照射后孢子悬液不应贮放太久，处理后的培养样品需用黑纸或黑布包裹，避免长波紫外线和可见光的照射［26］。本试验经过紫外诱变选育获得了一株细胞干重和丁二酸产率均有明显提高的高产菌株Z1，与诱变处理前的菌株相比，丁二酸的产率提高了46%。经形态学特征、生理生化指标测定以及16S rDNA序列分析等，鉴定Z1菌株为放线杆菌。本试验经过筛选和选育得到的菌株Z1，在丁二酸的发酵生产能力上处于自然菌属发酵结果的较高水平，但与目前报道的利用基因工程手段获取的重组大肠杆菌发酵丁二酸的结果相比，还有一定的差距。因此，利用代谢控制发酵和基因工程手段，进一步提高丁二酸的发酵水平，将成为今后研究的重点方向。

4 结论

本研究利用溴甲酚绿指示剂的固态培养基作为选择性平板，分离得到了生产丁二酸的单一菌落。通过荧光圈初筛法初步筛选得到了两株产丁二酸水平较高的菌株Y3和Y4，然后利用高效液相法对初筛优势菌株进行发酵复筛检验，得到产丁二酸产率较高的菌株G3，并对菌株G3进行紫外线诱变选育处理，获得了一株细胞湿重和丁二酸产率均有明显提高的高产菌株Z1，与诱变处理前的菌株G3相比，丁二酸的产率提高了46%，在底物葡萄糖浓度为100 g/L的发酵培养条件下，Z1菌株的丁二酸发酵产量为50.30 g/L，葡萄糖残留浓度为9.0 g/L。经形态学特征、生理生化指标测定以及16S rDNA序列分析等，鉴定Z1菌株为放线杆菌。

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（责任编辑 马鑫）

Screening and Breeding of a Strain for High Yield of Succinic Acid

Wang Le Yu Guanghai Yang Shuoye Wang Weiwei Hui Ming
（College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

It was to improve the production of succinic acid. After the primary and secondary screening， a strain with high-yield of succinic acid was isolated from the soil. The succinic acid production of 34.45% was determined by the high performance liquid chromatography（HPLC）after the fermentation. Later， the UV mutagenic breeding of strains has been performed， resulting in the succinic acid production of 50.30% which increased by 46% in the substrate of glucose concentration of 100 g/L with the residual sugar lower than 10 g/L. After the determinations of morphological characteristics， physiological and biochemical index and 16S rDNA sequence analysis， the strain was identified as actinobacillus.

succinic acid；high-producing strain；screen；mutagenesis；Actinobacillus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.018

2014-08-04

国家自然科学基金项目（21306040）

王乐，男，博士，讲师，研究方向：微生物学，发酵工程；E-mail：wanglely1984@163.com

惠明，男，博士，教授，研究方向：发酵工程；E-mail：huiming69@163.com