水稻OsSHAT1和OsRSR1应答激素及逆境胁迫的表达特性

李哲张少绚黄荣峰

（1. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2. 青岛农业大学生命科学学院，青岛 266000）

水稻OsSHAT1和OsRSR1应答激素及逆境胁迫的表达特性

李哲1张少绚2黄荣峰1

（1. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2. 青岛农业大学生命科学学院，青岛 266000）

旨在研究AP2家族类因子是否参与逆境胁迫应答过程。通过序列比对发现，水稻OsSHAT1和OsRSR1蛋白序列一致性达41.92%，表明OsSHAT1和OsRSR1是同源性较高的AP2家族因子；且OsSHAT1和OsRSR1基因启动子序列都包含有ABRE、DRE、MYB、MYC、WRKY、GCC-box和ERE等应答不同胁迫及激素信号的元件。基因表达分析表明，OsSHAT1受低温、NaCl、ABA、ACC抑制，受干旱诱导表达；而OsRSR1受低温、干旱、ABA、ACC抑制，受NaCl诱导表达。推测OsSHAT1和OsRSR1可能通过不同的转录调控方式影响耐逆相关基因的表达，进而调节水稻不同的逆境胁迫反应。

AP2；OsSHAT1；OsRSR1；非生物胁迫；水稻

AP2/ERF家族是一个庞大的转录因子超家族，该家族基因编码蛋白序列中具有典型AP2/ERF DNA结合结构域。ERF结构域第一次作为一个保守的结构域的报道是在1995年，由Ohme-Takagi和Shinshi在烟草的4个DNA结合蛋白（ERF1-4）中发现的，该结构域能够与一类响应乙烯信号的基因启动子中的GCC序列相结合［1］。根据AP2/ERF结构域的数量以及基因功能可以将AP2/ERF超家族分为4个家族，包括AP2、ERF、RAV和DREB［2］。AP2家族蛋白具有两个AP2/ERF结构域，并且能够分成两个同宗群AP2和ANT（AINTEGUMENTA）［3］；ERF家族蛋白包含一个AP2/ERF结构域，根据该结构域结合的DNA序列的不同，ERF家族进一步分成ERF和CBF/DREB亚家族。ERF亚家族蛋白能够结合AGCCGCC核心序列，CBF/DREB则能够识别干旱和低温响应元件A/GCCGAC［4］；RAV家族蛋白除了具有一个AP2/ERF结构域，还含有一个B3结构域。

AP2/ERF转录因子作为一类十分重要的转录调控因子家族，几乎存在于所有的植物当中。目前，随着多种植物的全基因组测序完成，AP2/ERF家族已经在拟南芥、葡萄、白杨和水稻中鉴定出来，其基因组中分别包含了145、132、200和163个该家族的基因［5］。许多研究表明，AP2/ERF转录因子在参与多种生物学过程的调控当中发挥着关键作用，包括植物生长、花、果实、种子的发育，并且在植物应对机械损伤、病菌侵染、高盐、干旱、低温等环境胁迫中也起到十分重要的调控作用。另外，AP2/ERF类转录因子还能够参与到多种植物激素信号转导与代谢途径当中，如脱落酸、乙烯、茉莉酸、油菜素内酯以及赤霉素等，并且能够通过调控这些植物激素途径参与到植物逆境胁迫反应当中。当植物感受到逆境胁迫信号时，能够在转录水平上调控相关基因的表达，从而增强植物对不良环境的适应能力。植物激素在这一过程中起着不可或缺的作用，特别是乙烯、脱落酸对调控植物盐胁迫、干旱胁迫等非生物胁迫反应十分关键。

ERF和RAV家族因子在响应激素信号，调节生物和非生物胁迫反应中发挥着重要作用［6-8］。 其中，DREB类转录因子能够响应多种逆境胁迫信号。如水稻OsDERF1是响应干旱胁迫的ERF类基因，可通过调控转录抑制子OsAP2-39和OsERF3基因的表达负调控乙烯合成，影响水稻耐旱性［9］。OsDREB1F 受高盐、干旱、冷胁迫和ABA处理诱导，但不受病原菌、机械损伤和双氧水处理诱导，OsDREB1F 基因的转基因水稻和拟南芥对高盐、干旱和低温的抗性增强［10，11］。SERF1基因属DREB亚家族中第二类ERF基因，在参与水稻盐胁迫反应中Na+区室化作用以及H2O2的清除反应中发挥作用［12］。拟南芥中的研究也揭示了乙烯信号途径参与到盐胁迫反应当中。ESE1表达受乙烯和NaCl的诱导，并受EIN3的直接调控，ESE1蛋白进一步结合盐相关基因RD29A和 COR15A启动子，调控拟南芥盐胁迫反应［13］。

AP2家族基因主要参与植物发育调控［14-16］。最早证明AP2基因调控植物发育的证据是由Jufuku等［17］在模式植物拟南芥中发现的一个AP2基因，该基因含有两个AP2结构域，参与花发育的调控。番茄AP2家族基因SlAP2a在果实发育和成熟过程中表达， 并通过负调控乙烯的合成影响果实的成熟，说明SlAP2a在果实发育过程中发挥重要的作用［18］。水稻SNB 基因编码的蛋白属于禾本科植物特有IDS1 家族成员，含有两个AP2 结构域，该基因在发育中的小穗表达量最高，是小穗分生组织向花分生组织正确转变以及花器官模式的正确形成所必需的，SNB 基因突变后小穗分生组织向花分生组织转变延迟而苞叶形成的时期延长［19］。

虽然大量研究表明AP2家族基因能够在调控植物生长发育中发挥作用，但是该家族基因在响应激素和非生物胁迫中的作用却鲜有报道。本研究利用RAP-DB水稻数据库搜索到具有2个AP2结构域的 基 因OsSHAT1（SHATTERING ABORTION1；Os-04g0649100）和OsRSR1（RICE STARCH REGULATOR1；Os05g0121600），已有研究表明这两个AP2家族基因在调控水稻发育中发挥作用。其中OsSHAT1通过调节离层区的发育调控水稻落粒性，而OsRSR1的功能则在于影响水稻籽粒中淀粉的合成［20，21］，但二者是否能够在逆境胁迫中发挥作用尚不清楚。本研究通过对OsSHAT1和OsRSR1基因的蛋白序列、启动子元件以及不同非生物胁迫和激素处理条件下的表达特性进行分析，旨在为探究OsSHAT1和OsRSR1在逆境胁迫中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以粳稻品种日本晴（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Nipponbare）为供试材料。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 选取饱满的日本晴水稻种子，37℃温箱中浸种2 d，待种子露白后，种于松软的土壤中，置于温室（26℃，16 h光照/8 h黑暗）中培养，生长两周的幼苗用于逆境胁迫和激素处理。

NaCl（盐胁迫）、ABA和ACC处理采用喷施叶片的方法。处理组的水稻幼苗利用超纯水配制的200 mmol/L NaCl溶 液、100 μmol/L ABA和100μmol/L ACC溶液充分喷施叶片［22-24］，NaCl和ACC处理的对照组幼苗同时进行超纯水喷施处理（ACC母液溶剂为超纯水）；ABA处理的对照组根据ABA工作液中乙醇的浓度配制相应浓度乙醇水溶液进行喷施（ABA母液溶剂为无水乙醇），排除溶液中存在的微量乙醇对基因表达的干扰，取样时间设置为0、0.5、1、2、4和8 h；干旱处理，将根部土壤小心清洗干净，尽量避免根部损伤，然后转移到1/2MS液体培养基中恢复培养24 h，再转移到含有20% PEG6000的1/2MS液体培养基中模拟干旱处理，此过程中，对照组幼苗在1/2MS液体培养基中持续培养。由于水稻幼苗对此模拟干旱条件较为敏感，因而将取样时间缩短，设置为0、0.5、1、2、4和6 h；低温胁迫处理，将幼苗置于10℃培养箱中（16 h光照/8 h黑暗），同时将对照组水稻幼苗置于26℃培养箱中（16 h光照/8 h黑暗），取样时间点为0、0.5、1、2、4和8 h。剪取叶片样品时，每份至少选取3株水稻幼苗相同部位的叶片，并将取得的叶片材料迅速置于液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 qPCR检测基因表达 分别提取不同处理后的水稻叶片总RNA，并反转录成cDNA（TIANGEN反转录试剂盒），用于荧光定量PCR分析（IQ5，Bio-Rad）。qPCR反应体系为cDNA模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，EVA Green mix（abm）10 μL，ddH2O 8 μL；反应程序为：95℃预变性10 min；95℃变性 15 s，58℃退火15 s，72℃延伸20 s，45个循环。Real-time PCR溶解曲线以1℃/min的速率从55℃升温至95℃，仪器记录荧光信号并绘制出扩增产物的熔解曲线。以actin为内参，设置0 h的基因表达量为1，得到处理不同时段相对基因表达水平。目的基因及内参基因引物序列为：qSHAT1-F：5'-CAACCGCTACAGCAGCTGCA-3'，qSHAT1-R：5'-GACGATGAATGCAGCGATCTTG-3'；qRSR1-F：5'-GATAGCGGCTCCCTTGGC-3'，qRSR1-R：5'-TGGCTTCTTTCCTTTTTATCAA-3'；ACTIN-F：5'-GACCTTGCTGGGCGTGAT-3'，ACTIN-R：5'-GTCATAGTCCAGGGCGATGT-3'。

1.2.3 生物信息学分析 利用RAP-DB水稻数据库（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）查询基因和蛋白序列；Motif scan软件（http：//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN）分析蛋白质结构域；GenBank查询启动子序列（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）；蛋白序列比对利用DNAMAN和ClustalW软件；系统进化分析采用MEGA5.1软件，Neighbor-Joining方法聚类，bootstrap设置为500个重复。启动子元件分析利用Place数据库（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）。

2 结果

2.1 水稻OsSHAT1和OsRSR1的生物信息学分析

蛋白质结构分析显示，OsSHAT1和OsRSR1蛋白结构中具有两个AP2/ERF结构域，是AP2家族转录因子的典型特征。其C-端分别具有LxLxL和L/FDLNL/F（X）P类型的EAR模体，该结构域可能在转录因子某些调控途径中发挥抑制作用。OsSHAT1和OsRSR1蛋白序列一致性为41.92%（图1），表明OsSHAT1和OsRSR1是同源性较高的AP2家族因子。通过RAP-DB数据库BLASTP搜索获得了17个与OsSHAT1和OsRSR1具有较高序列一致性（＞40%）的AP2家族基因，进化关系分析发现在这19个基因当中，OsSHAT1和OsRSR1在进化关系上最近，同时它们与另外两个调控水稻小穗发育的基因SNB（SUPERNUMERARY BRACT；Os07g0235800）、OsIDS1（ INDETERMINATE SPIKELET 1；Os03g08188-00）［25］也在进化关系上较近（图2），都具有两个AP2/ERF结构域以及EAR模体，并且都受到mirR172（a-d）的调控［26］，说明这些基因可能属于同一进化分支，在水稻花发育以及种子的成熟中共同发挥调控作用。

2.2 OsSHAT1和OsRSR1基因启动子元件分析

植物响应逆境和激素信号可以通过某些转录因子调节相关基因的表达水平来实现。因而，如果相关基因启动子序列中存在响应逆境胁迫和激素信号的元件，说明其可能参与应答这些信号。对OsSHAT1和OsRSR1起始密码子ATG上游2 kb启动子区域进行分析，结果表明OsSHAT1启动子中含有6个ABRE-like（ACGTG）元件，分别位于-743、-809和互补链的-529、-964、-978、-1 256位碱基；其互补链的-1 539位含有1个DRE（RCCGAC）元件；3个MYB元件（CNGTTR）分别位于互补链的-860、-1 623、-1 834位；2个MYC元件（CATGTG）位于-436和-1 951位；3个GCC核心元件（GCCGCC）位于-496、-564和互补链的-1 415位；另外还包括8个WRKY元件（TGAC），位于-393、-740、-910、-1 541、-1 555位和互补链的-333、-415、-423位（图3-A）。OsRSR1启动子中同样包含这些元件，其中3个ABRE-like元件分别位于互补链的-763、-1 024、-1 630位；2个DRE元件，一个位于-1 439位，另一个位于互补链的-1 757位；4个MYB核心元件分别位于互补链的-27、-559、-945、-1 417位；4个MYC元件分别位于-1 287、-1 367、-1 395、-1 885位点；9个WRKY元件分别位于-1 539、-1 579、-1 969位，互补链的-519、-557、-1 075、-1 176、-1 249、-1 709位（图3-B）；另外还包含一个乙烯响应元件ERE，位于互补链的-125位。这些启动子元件可能在响应ABA、乙烯以及非生物胁迫信号中发挥作用，从而调控下游抗逆相关基因的表达。

图1 OsSHAT1和OsRSR1蛋白序列比对

图2 OsSHAT1和OsRSR1水稻同源基因系统进化分析

2.3 不同逆境胁迫处理条件下OsSHAT1和OsRSR1的表达分析

为探究OsSHAT1和OsRSR1能否对某些非生物胁迫产生应答反应，对日本晴水稻幼苗进行10℃低温、干旱和200 mmol/L NaCl处理。荧光定量PCR检测基因表达水平。结果表明，OsSHAT1和OsRSR1的表达都受到低温的抑制，并且对低温胁迫十分敏感。处理0.5 h时，两个基因的表达明显下调，OsSHAT1基因的表达水平相对于0 h降低了39%，而RSR1受到抑制作用更为显著，表达量仅为0 h的10%。随着处理时间的延长，OsSHAT1表达逐渐降低，处理8 h时，表达水平下降了74%，OsRSR1的表达则存在明显的波动，可能受到其他因素的影响（图4-A）。干旱和NaCl处理时，OsSHAT1和OsRSR1的表达具有明显差异。OsSHAT1表达受到干旱胁迫的诱导，受高盐胁迫的抑制；但OsRSR1的表达受到干旱胁迫的抑制，而受NaCl胁迫的诱导。干旱胁迫时，OsSHAT1基因表达迅速上调，0.5 h达到最高峰，是0 h表达量的3.5倍，随后迅速下降；OsRSR1基因表达量则随着时间延长不断下降，最低表达水平仅为0 h时的10%（图4-B）。NaCl对OsSHAT1的抑制作用较为平缓，0.5 h时的表达水平下降到处理前的80%，并在1 h时达到最低，为对照值的43%，随后逐渐恢复正常水平。NaCl对OsRSR1的诱导，发挥作用较慢，处理2 h表达量才显著上升，达到对照的2.6倍（图4-C）。这些结果表明，OsSHAT1和OsRSR1基因能够响应低温、干旱和NaCl胁迫，其不同的表达情况说明它们在水稻应对环境中非生物胁迫时所发挥的作用存在差异，这其中可能存在十分复杂的相互作用和精细调控。

图3 OsSHAT1（A）和OsRSR1（B）启动子元件分析

图4 低温（A）、干旱（B）、NaCl（C）处理时OsSHAT1和OsRSR1的表达分析

2.4 不同激素处理条件下OsSHAT1和OsRSR1的表达分析

许多研究表明，植物激素特别是ABA和乙烯在调控非生物胁迫反应中起着十分重要的作用。因而，对ABA和乙烯信号的响应也部分反应了某些基因在逆境胁迫中的作用。对日本晴水稻幼苗进行ABA和乙烯合成前体ACC处理后检测基因表达情况发现，ABA和ACC抑制OsSHAT1和OsRSR1的表达，但抑制程度不同，OsRSR1的表达受到的抑制作用更显著。ABA处理0.5 h时，OsSHAT1基因表达水平为0 h的65%，OsRSR1为6%（图5-A）。同样，ACC处理0.5 h时，OsSHAT1表达量为0 h时的39%，OsRSR1则仅为5%（图5-B）。结果表明，OsSHAT1和OsRSR1能在不同程度上响应植物激素ABA和乙烯信号，并可能通过这些激素信号途径调控相关基因表达，影响水稻抗逆性。

图5 ABA（A）、ACC（B）处理时OsSHAT1和OsRSR1的表达分析

3 讨论

低温、高温、干旱、高盐等非生物胁迫严重影响植物的生物量进而影响作物产量。为应对这些不利环境，植物体发展出多种复杂的信号途径应对环境压力。转录因子构成了这样复杂的调控网络的主要成分，能够及时有效的发挥信号转导作用，减少不良环境对植物体的损伤［27］。模式植物拟南芥和水稻中已经鉴定出多个转录因子家族，包括AP2/ERF、MYB、WRKY和NAC家族，这些家族的很多成员都参与了植物逆境胁迫反应的调控［28］。其中AP2/ERF转录因子家族，能够结合DRE/CRT、GCC-box 等顺式作用元件，并通过乙烯或ABA的植物激素依赖的信号途径调控生物或非生物胁迫反应［29］。如OsERF922属于AP2/ERF类转录因子，过表达OsERF922降低了水稻对盐胁迫反应的耐受力［30］；增强转录因子OsDREB2A的表达则能够提高水稻对干旱和盐胁迫的耐受力［31］。将大豆中AP2/ERF类转录因子GmERF3在烟草中表达能够增强烟草对盐、干旱胁迫和病原菌的抗性［32］。

AP2/ERF转录因子超家族中，AP2家族成员蛋白结构中包含两个AP2/ERF结构域，许多研究表明该家族基因在调控植物发育中发挥作用，如APETALA2调控拟南芥花的发育和芽分生组织细胞大小［33，34］；玉米中microRNA172能够下调AP2亚家族基因Glossy15进而促进营养生长阶段的过渡［35］；OsSHAT1和OsRSR1基因同样也在调控水稻发育中具有十分重要的作用，其功能分别为调控水稻落粒性和籽粒中淀粉的合成。但是AP2家族基因在响应非生物胁迫中的作用鲜见报道。本研究对两个AP2家族基因OsSHAT1和OsRSR1的蛋白序列、逆境及激素处理条件下的表达特性进行了分析。蛋白序列分析结果表明，OsSHAT1和OsRSR1具有AP2家族蛋白典型的2个AP2/ERF结构域，同时在其C-端具有EAR模体，说明OsSHAT1和OsRSR1可能在某些基因的表达调控中发挥抑制作用。启动子元件分析显示，OsSHAT1和OsRSR1基因启动子序列中都存在多个应答非生物胁迫以及植物激素乙烯、ABA的顺式作用元件，包括ABRE-like、MYB、MYC、WRKY、DRE、GCC-box和ERE，这些元件在植物响应环境中的逆境胁迫信号中发挥重要作用。如拟南芥AtMYC2转录因子能够与RD22基因启动子中的MYC元件结合，并激活RD22基因的表达，导致ABA和干旱诱导基因表达上调［36］。诱导表达分析结果表明，OsSHAT1的表达受到低温、NaCl、ABA、ACC的抑制，受干旱诱导；OsRSR1的表达受低温、干旱、ABA、ACC的抑制，受NaCl的诱导。这些结果说明OsSHAT1和OsRSR1能够响应激素及逆境胁迫信号，并且在感受到这些信号时其表达迅速发生变化，进而及时有效地调控下游逆境相关基因的表达，来应对不良环境，而这些基因表达变化则可能通过某些转录因子与其启动子中响应逆境和激素信号的相关元件结合来实现。另外，不同的逆境胁迫，特别是干旱和盐胁迫对OsSHAT1和OsRSR1的表达影响是不同的，说明OsSHAT1和OsRSR1在应对不同的逆境胁迫时所发挥的功能存在差异，它们之间可能通过相互作用或参与共同的调控网络对水稻应对环境压力产生十分精细的调节作用。根据以上结果，推测OsSHAT1和OsRSR1作为AP2家族基因，不仅在水稻发育中起到调控作用，还可能在应对非生物胁迫中通过转录调控发挥功能。

4 结论

本研究利用RAP-DB水稻数据库搜索到两个AP2家族基因OsSHAT1和OsRSR1。蛋白序列比对发现，OsSHAT1和OsRSR1序列一致性达41.92%，其蛋白结构中具有两个AP2/ERF结构域，并在C-端含有一个EAR模体。系统进化分析表明，二者在进化关系上较近。启动子元件分析显示，OsSHAT1和OsRSR1启动子序列中都包含响应非生物胁迫和激素信号的顺式作用元件，包括ABRE-like、MYB、MYC、WRKY、DRE、GCC-box和ERE。诱导表达分析的结果表明，OsSHAT1受低温、NaCl、ABA、ACC抑制，受干旱诱导表达；而OsRSR1受低温、干旱、ABA、ACC抑制，受NaCl诱导表达。

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［36］Abe H， Urao T， Ito T， et al. Arabidopsis AtMYC2（bHLH）and AtMYB2（MYB）function as transcriptional activators in abscisic acid signaling［J］. The Plant Cell， 2003， 15（1）：63-78.

（责任编辑 马鑫）

The Expression of Rice OsSHAT1 and OsRSR1 in Response to Hormones and Abiotic Stresses

Li Zhe1Zhang Shaoxuan2Huang Rongfeng1
（1. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2. College of Life Science，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266000）

It was to research whether AP2 family factors involved in the stress response process. In this study， sequence alignment revealed that OsSHAT1 and OsRSR1 proteins share 41.92% sequence identity， indicating that OsSHAT1 and OsRSR1 are homologous members of AP2 family. And the promoter sequences of OsSHAT1 and OsRSR1 genes contain multiple stress and hormone responsible cis-acting elements，such as ABRE， DRE， MYB， MYC， WRKY， GCC-box and ERE. Transcript analysis showed that the expression of OsSHAT1 was suppressed by low temperature， NaCl， ABA， ACC， but induced by drought；while the transcripts of OsRSR1 was inhibited by low temperature， drought，ABA and ACC， but enhanced by NaCl. It is speculated that OsSHAT1 and OsRSR1 may influence the expression of stress related genes by transcriptional regulation in differential ways， and then adjust the distinctive stress response of rice.

AP2；OsSHAT1；OsRSR1；abiotic stress；rice

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.012

2014-11-07

国家转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08009-015B）

李哲，男，硕士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物学；E-mail：lizhe0120@yeah.net

黄荣峰，男，研究员，博士生导师，研究方向：作物抗逆生理与遗传改良；E-mail：rfhuang@caas.cn