液质联用法测定葡萄酒中多菌灵、甲霜灵的残留

陈军，樊继鹏，2，谢鑫陟，2

（1.苏州出人境检验检疫局检验检疫综合技术中心，江苏苏州215104；2.苏州世标检测技术有限公司，江苏苏州215104）

液质联用法测定葡萄酒中多菌灵、甲霜灵的残留

陈军1，樊继鹏1，2，谢鑫陟1，2

（1.苏州出人境检验检疫局检验检疫综合技术中心，江苏苏州215104；2.苏州世标检测技术有限公司，江苏苏州215104）

建立葡萄酒样品中多菌灵和甲霜灵残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。调节样品pH，用乙腈提取，经氨基固相萃取柱净化后，以多离子反应检测模式（MRM）进行测定。多菌灵及甲霜灵最低检出限为0.05 μg/L，在0.0 μg/L～5.0μg/L的线性范围内，相关系数为0.999。多菌灵在葡萄酒中加标回收率为60%～90%，相对标准偏差（RSD）2.2%～12.6%；甲霜灵加标回收率为80%～105%，相对标准偏差（RSD）2.0%～8.2%。

超高效液相色谱-串联质谱法；甲霜灵；多菌灵；葡萄酒

近两年，国内外多次在葡萄酒中检测出甲霜灵、多菌灵残留，其中，甲霜灵（metalaxyl）属苯基酰胺类高效低毒内吸性杀菌剂［1-2］，主要应用于葡萄酒霜霉病的防治［3］；多菌灵（Carbe-ndazim，MBC），是一种广谱、内吸附性杀菌剂，可有效预防葡萄白腐病、炭疽病、黑痘病、霜霉病、炭疽病等［4-9］。这两类农药对人体存有致癌或致遗传性疾病的风险［10］。因此，适时研究葡萄酒中甲霜灵、多菌灵检测方法，对维护国内外葡萄酒行业规范及健康发展具有现实意义。

目前，文献报道的葡萄酒中农药残留的检测方法有液相色谱法［11］、气相色谱法［12-13］、气相色谱-质谱联用法［14］、液相色谱-质谱联用法等［15］。但对于葡萄酒中同时检测甲霜灵、多菌灵的检测方法研究较少［3，7］。本研究通过固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中甲霜灵残留，能够克服葡萄酒中基质干扰大等因素，可以满足葡萄酒中甲霜灵、多菌灵残留的痕量检测需求。

1　材料与方法

1.1仪器和设备

APITripleQuad4500超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪：ABSCIEX公司；XS105天平：Mettler Toledo；NH2固相萃取柱：1 g/6mL，美国waters公司。

1.2试剂与标准品

多菌灵（Carbendazim，标准品），甲霜灵（Metalaxyl，标准品），氯化钠（Sodiumchloride，GR级），甲苯（Methylbenzene，HPLC级）皆购于百灵威科技有限公司；乙腈（Acetonitrile，HPLC级）购于上海安谱科学仪器有限公司；蒸馏水（苏州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心食品理化实验室制，符合GB/T 6682-2008分析实验室用水规格）。

1.3样品预处理

1.3.1样品提取

准确称取2.000 0 g样品（精确至1 mg）于10 mL具塞比色管中，用0.5 mol/L氢氧化钠调节待测样品pH至7.5，加入8 mL乙腈漩涡1 min混匀，加3.0 g氯化钠，漩涡1 min混匀，于4 500 r/min，离心5 min，分层后，吸取上清液4 mL待净化。

1.3.2样品净化

加入2.5 g无水硫酸钠于NH2固相萃取柱中，先用5 mL甲苯+乙腈（3+1）进行预洗柱，当液面达到硫酸钠顶部时，将1.3.1中待净化液进行固相萃取，并用15 mL具塞管接收，然后用5 mL甲苯+乙腈（3+1）洗涤样瓶3次，再将洗涤液移入固相萃取柱中，合并具塞管中样液，并于45℃水浴条件下，旋转蒸发浓缩至约0.5 mL。将浓缩液置于氮吹仪上，45℃水浴条件下氮吹至近干，迅速加入80%乙腈水溶液回溶，超声混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱测定。

1.4高效液相色谱条件

色谱柱：InertsilC8，5μm，150mm×2.1 mm（内径）；柱温：30℃；流速：0.25 mL/min；进样量：20 μL；流动相：2.5 mmol/L 0.3%乙酸水溶液和0.3%乙酸的乙腈溶液梯度洗脱；具体洗脱条件如下：

表1　色谱梯度洗脱条件Table 1Chromatography gradient elution conditions

1.5质谱条件

离子源：ESI源；扫描模式：多反应监测；优化的去簇电压和碰撞能量参数如下表2所示。

表2　质谱采集参数Table 2Mass spectrum acquisition parameters

1.6实验条件的优化

1.6.1待测样品pH条件的优化

分别考察了pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0不同梯度对葡萄酒中多菌灵、甲霜灵提取率的影响，样品经处理，进液质联用仪进行检测分析。

1.6.2萃取剂的优化

选定好待测样品的pH考察不同萃取剂正己烷、乙酸乙酯、乙腈对葡萄酒中多菌灵、甲霜灵提取率的影响，样品经处理，进液质联用仪分析检测。

1.6.3固相萃取柱的选择

考察了氨基固相萃取柱与石墨化碳/氨基复合固相萃取柱两种固相萃取柱对多菌灵、甲霜灵萃取效果的影响，样品进液质联用仪分析检测。

1.6.4条件的优化

参照1.3样品处理方法及1.4和1.5的色谱条件，样品经加标后采用3水平6平行实验，进行检测分析，以验证检测方法可行性。

1.7数据处理

各指标值测定均重复6次（n=6），用EXCEL软件进行数据分析，用SAS 9.0软件进行Duncan新复极差分析。

2　结果与分析

2.1标准工作曲线的建立

称取标准品多菌灵和甲霜灵，用乙腈稀释溶解定容，配制成10 μg/L混标，再分取一定体积用80%乙腈稀释溶解定容。分别配制成浓度为0.00、0.05、0.10、0.50、1.0、2.0、5.0μg/L的标准使用液，上机测定。以峰面积为y，浓度μg/L为x，计算出：甲霜灵标准曲线（y= 2.05×106x+1.77×105，γ=0.99 92），详见图1（a）；多菌灵标准曲线（y=2.68×106x+6.56×104，γ=0.9993），详见图1（b）。

2.2待测液总离子流图

图2为甲霜灵、多菌灵待测液总离子流图。

2.3待测样品pH条件的选择

考察了不同pH条件对多菌灵、甲霜灵的萃取效果，其测定结果如表3所示。

图1　（a）甲霜灵线性回归曲线Fig.1（a）The linear regression curve of the metalaxyl

图1　（b）多菌灵线性回归曲线Fig.1（b）The linear regression curve of the carbendazim

图2　甲霜灵、多菌灵待测液总离子流图Fig.2Total ion chromatogram of the metalaxyl and carbendazim’s fluid under test

由表3可以看出，在pH=8.0时，所测样品中多菌灵、甲霜灵的回收率较好。这由于多菌灵属于一种两性化合物，在中性或偏碱性水溶液中溶解度低，通过调节溶液的碱性条件可增强多菌灵在有机溶剂中的溶解度［16］，但随着碱性条件的增强，多菌灵会发生缓慢分解，伴随pH升高分解加快，同时，甲霜灵在中性及弱酸性条件下较稳定，遇碱也易分解。所以，选定pH= 8.0作为待测样品的pH条件。

表3　干红葡萄酒中不同pH条件下多菌灵、甲霜灵空白加标回收率测定结果Table 3The recovery of metalaxyl and carbendazim of under the condition of different pH

2.4萃取剂的选择

调节酒样条件为pH=8.0，分别考察了正己烷、乙酸乙酯、乙腈作为萃取溶剂对葡萄酒中多菌灵、甲霜灵的萃取效率的影响，检测结果如表4所示。

表4　不同固相萃取剂的测试结果Table 4The testing results of different solid phase extracting agent

由表4可以看出，三种溶剂，萃取效果差异显著（P＜0.05），采用乙腈萃取，目标物的综合回收率均较好。因此，本研究选用乙腈作为萃取溶剂。

2.5固相萃取柱的选择

由于葡萄酒中基质较为复杂，净化不充分直接上机会对仪器测定造成干扰，文献报道多采用固相萃取柱净化的方法降低基质干扰［17-19］，而不同类型的固相萃取柱是影响样品净化及方法回收率的重要因素，本研究分别考察了氨基固相萃取柱与石墨化碳/氨基复合固相萃取柱两种固相萃取柱对多菌灵、甲霜灵的萃取效果，其检测结果见表5。

表5　不同固相萃取柱的测试结果Table 5Test results of different solid phase extraction column

由表5可以看出，氨基固相萃取柱对待测组分的萃取效果优于石墨化碳/氨基复合固相萃取柱。其中，石墨化碳在去除色素等杂质上优于氨基固相萃取柱［20］，但对目标物有一定吸附作用。而样品经过乙腈萃取后，用氨基固相萃取柱足以去除待测酒样的色素等杂质，且回收率高于石墨化碳/氨基复合固相萃取柱萃取效果，因此，本实验选用氨基固相萃取柱。

2.6方法回收率及检出限

实验过程中采用基质加标进行配制标准曲线，以控制整个实验过程中是否有人为或环境因素带来的污染，并验证实验过程的精密性与准确性。以浓度0.2、0.4、2.0 μg/L的目标化合物制备标准小样，进行回收率实验，另以相同基质样品做空白实验，测定结果为：多菌灵空白加标回收率在60%～90%，RSD为2.2%～12.6%，甲霜灵空白加标回收率在80%～105%，RSD为2.0%～8.2%，二者方法检出限均能达到0.05μg/L，具体结果如表6、表7所示。

表6　干红葡萄酒中多菌灵空白加标回收率测定结果Table 6The determination results of the carbendazim’s addition recovery rate

表7　干红葡萄酒中甲霜灵空白加标回收率测定结果Table 7The determination results of the metalaxyl’s addition recovery rate

3　结果讨论

本研究通过调节酒样pH，利用乙腈进行萃取，加入氯化钠盐析分层后，用氨基固相萃取柱进行净化、富集目标物，分析物通过乙腈水溶液回溶后由液相色谱-四极杆串联质谱联用仪（LC-MS）进行检测，所测得对多菌灵（carbendazim）、甲霜灵（metalaxyl）的回收率及检出限能满足葡萄酒中农药残留的检测需求。

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Determination of Carbendazim and Metalaxyl in Wine by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

CHEN Jun1，FAN Ji-peng1，2，XIE Xin-zhi1，2
（1.Inspection and Quarantine Technical Center，Suzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Suzhou 215104，Jiangsu，China；SuzhouWorld Standard Testing Technology Co.，Ltd.，Suzhou 215104，Jiangsu，China）

An analytical method was developed for the determination of carbendazim and metalaxyl in wine by using ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.The pH of the wine was adjusted.The pesticides were extracted by acetonitrile，and cleaned up by NH2solid phase extraction column，then quantified with multiple reactions monitoring（MRM）.The limits of detection for both pesticides were 0.05 μg/L.Calibration curves exhibited good linearity over the concentration range from 0.00 μg/L to 5.0 μg/L，with their correlation coefficients above 0.999.Average recoveries for carbendazim spiked at 3 levels ranged from 60%to90%，with a relative standard deviations（RSD）range from 2.2%to12.6%.Average recoveries for metalaxyl spiked at 3 levels ranged from 80%to 105%，with a RSD range from 2.0%to 8.2%.

ultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry；metalaxyl；carbendazim；wine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.027

2014-05-09

进口葡萄酒鉴定技术及有毒有害物质检测（SYN201215）作者简介：陈军（1965—），男（汉），研究员，博士，研究方向：食品质量安全。