HPLC法测定掺假玉米馒头中的柠檬黄含量

汪芳芳 呙亮 康翠欣 彭玲玲 柴文娟

摘 要：建立了氨水甲醇溶液直接萃取-高效液相色谱法测定掺假玉米馒头中柠檬黄含量的方法。柠檬黄的线性范围为0.5-1000mg/kg，线性方程的相关系数大于0.99，加标回收率在93%-110%之间，相对标准偏差均小于9.1%。柠檬黄的检测限为0.02mg/kg。该方法简单、可靠、提取效果好，测定结果满意，适用于掺假玉米馒头中衡量柠檬黄的定量分析。

關键词：直接萃取；掺假玉米馒头；柠檬黄；高效液相色谱法

中图分类号：TB

文献标识码：A

文章编号：16723198（2015）20022702

1 引言

玉米被称为是抗癌、防衰的粗粮佳品。玉米富含VE和VA，玉米中的VB1、VB2、烟酸和铁质等高出大米4倍。玉米所含的脂肪为米面的4～5倍，而且富含不饱和脂肪酸，其中50%为亚油酸，还含有谷固醇、卵磷脂等，能降低胆固醇，防止高血压、冠心病、心肌梗塞的发生，并具有延缓脑功能退化的作用。馒头是我国的传统主食，玉米馒头及其他玉米制品的开发对改善广大人民群众的膳食结构、增强人民体质、增加农业附加值具有重要意义。

柠檬黄是一种食品常用的食品添加剂，添加适量柠檬黄的食品颜色饱满鲜亮，常用于饮料、蜜饯、酱腌菜等食品中。据报道，目前有不法商贩将柠檬黄添加到馒头制品中，制作出颜色鲜亮的掺假“玉米馒头”柠檬黄是一种水溶性的偶氮染料，长期食用将对大众的身体健康产生负面影响。

目前，检测固体食品中的柠檬黄，大都采用酸性水溶液浸泡提取后，以聚酰胺粉吸附提取液中的柠檬黄，再经氨水甲醇洗脱浓缩的方法。但存在酸性水溶液的提取能力差，聚酰胺粉吸附不完全，柠檬黄损失大的缺点。测定玉米馒头中柠檬黄含量的方法国内外均尚未见报道。

本文建立了氨化甲醇直接萃取-高效液相色谱法测定掺假玉米馒头中柠檬黄含量的方法。样品经5%氨水甲醇溶液直接萃取后，过滤，经冰乙酸调至中性，旋转蒸发浓缩近干，甲醇/水（50/50）溶液溶解并定容。以乙酸铵/甲醇为流动相梯度洗脱，经C18色谱柱分离，采用二极管阵列检测器检测。本方法简单、可靠、提取效果好，测定结果满意，适用于掺假玉米馒头中衡量柠檬黄的定量分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 996 PAD 二极管阵列检测器（美国waters公司）；涡旋混和仪；（上海沪西分析仪器厂，WH-3）超声清洗器（上海KUDOS超声仪器有限公司，SK7200LH）。

柠檬黄标准品（纯度大于99%，百灵威公司）用1∶1甲醇水配制成10μg/mL的标准储备液，于-4℃下避光保存，根据需要稀释成适当浓度的工作液。

2.2 实验方法

2.2.1 样品制备及预处理

空白样品制备：玉米粉量为30%、加水量为45%、发酵时间为3h、醒发时间为30min，蒸熟。

加标样品制备：玉米粉添加量为30%、加入不同浓度水平的柠檬黄水溶液的量为45%、发酵时间为3h、醒发时间为30min，蒸熟。制得柠檬黄添加水平分别为0.5、5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、300.0、5000、1000.0、1200.0、1500.0mg/kg的玉米馒头。

样品预处理：取20.0g玉米馒头样品置于2500mL具塞三角瓶中，然后加入150.0mL新鲜配制的5%氨水甲醇溶液，振荡混匀，静置12h后，过滤，将滤液用冰乙酸调至中性，70℃下旋转蒸发浓缩至近干，用甲醇/水（50/50）溶液溶解残渣并定容至5.00mL，过045μm滤膜，滤液供上机测定。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Acclaim 120 C18（4.6×250mm，5μm，美国戴安公司）；流动相：A相为20mmol乙酸铵溶液，B相为甲醇，等度洗脱（A∶B=16∶84）；流速：1.0mL/min；进样量：5.0μL；检测波长：420nm。

3 结果与讨论

3.1 萃取条件的优化

3.1.1 萃取方法及萃取液的选择

本文分别用5种不同提取液进行预处理，在上述色谱条件下进行分离检测，结果如表1所示。

由表1可见，单独使用甲醇回收率很低；使用乙腈做提取液回收率提高到43.5%，但仍不能满足分析的要求；1∶1甲醇与水的混合溶剂进行提取时发生浑浊，需进行12000r高速离心才能够分层。单独用5%氨水溶液提取，由于不能进行浓缩，仍无法满足分析要求。含有5%氨水的甲醇溶液进行提取，回收率在97%以上，效果最佳。另外，氨水与无水乙醇无法互溶，故无法使用。因此本研究确定提取液为5%氨水甲醇溶液。

3.1.2 提取液体积的优化

萃取液体积对回收率有重要影响。为了确保柠檬黄能够全部提取出来，本研究提高了样品中的添加水平（500mg/kg），先按照3.1.1确定的方法分别加入5000mL，100.00mL，150.00mL，20000mL，250mL5%氨水甲醇溶液，振荡混和，浸泡提取12h，进行分离检测。试验结果如图1所示，结果表明，提取液体积在大于150.00mL后，提取出的柠檬黄的总量不增加反降低。故本文提取液用量定为150.00mL。

3.1.3 萃取时间的优化

萃取时间可影响柠檬黄的回收率。分别称取5份加标样品（添加柠檬黄水平为100mg/kg），按照3.1.1和3.1.2节所述方法，分别加入150.00mL5%氨水甲醇溶液，涡旋混和后，分别超声提取1h，5h，10h，12h，15h，20h，30h，60h然后进行分离检测，结果如图2所示。结果表明，在萃取时间大于15h之后，柠檬黄的回收率基本不再增加。故本文萃取时间定为15h。

3.2 方法的线性范围，检出限，回收率和精密度

采用外标法定量，柠檬黄在样品中的线性范围为0.5～1000mg/kg，相关系数均大于0.99。以加标样品为测试样品，添加不同浓度水平的柠檬黄，每个水平做6个平行样，计算回收率、相对标准偏差（RSD），结果见表2。通过低浓度（0.5mg/kg）添加样品，以3倍信噪比为检出限（LOD），计算得出柠檬黄的检出限为002mg/kg，同样条件下，以10倍信噪比为定量下限（LOQ），计算出柠檬黄的定量下限为0.5mg/kg。

3.3 实际样品中柠檬黄的测定

测定了5份样品，均为武汉质检所日常检测所采集的样品。样品按照本文确定的前处理方法进行预处理后，以10μL直接进样分析，所得结果如表3所示。柠檬黄在5份样品中的回收率为94.6%～100.2%。

*ND：未检出（not detected）

采用氨水甲醇溶液直接萃取-高效液相色谱法测定掺假玉米馒头中柠檬黄含量的方法，具有检出限低，杂质干扰少，样品前处理步骤简单，回收率稳定等优点，可用于实际玉米馒头制品中柠檬黄的检测。

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