HPLC测定大鼠肝组织中多西紫杉醇含量

马建军 陈金凤 嗓晓静

摘要：目的： 建立高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠肝组织匀浆中多西紫杉醇的方法，考察多西紫杉醇大鼠尾静脉给药后肝组织中的浓度。方法： 以紫杉醇为内标，大鼠肝组织匀浆样品中多西紫杉醇经萃取后采用SymmetryShield RP18柱（5μm，250×4.6mm）色谱分析柱 ，流动相为乙腈-水（50：50）流速：1.0 ml/min，检测波长为231nm，进样量 20u L。大鼠尾静脉注射给予多西紫杉醇制剂，剂量为75mg/m2。经不同时间点解剖动物，用所建立的 HPLC法测定其肝组织中药物浓度。结果：紫杉醇和多西紫杉醇的保留时间分别是13.7 min 和11.4 min ， 肝组织样品中多西紫杉醇在0.986～49.3mg/L浓度范围内与峰面积之间线性关系良好 ，回归方程为Y = 1.587213X -5.959293e-002，绝对回收率和相对回收率分别为85%～100%、80% ～115%，日内 RSD为12.81%、7.17%、3.11% ，日间RSD为10.61% 、3.5%、9.38% ， 且稳定性良好。实测得多西紫杉醇在大鼠肝组织中的浓度为177.7～3904.3μg/g。结论：本试验建立的方法简便灵敏 ，干扰小 ，重复性好 ，可实际应用于多西紫杉醇在大鼠肝组织中的测定 ，并作为评价多西紫杉醇在靶组织分布的方法学依据。

关键词：多西紫杉醇； 肝组织； 高效液相色谱法

Abstract：Objective to establish HPLC method for determination of docetaxel in rat liver tissue，and to investigation the docetaxel concentration in rat liver tissue after intravenous administration .METHODS Taxol was used as internal standard. The docetaxel was extracted for two times determined through SymmetryShield RP18 column （5μm，250*4.6mn） chromatography column .The mobile phase consisted of water-acetonitrile （50：50） with the flow rates of 1.0ml/min.The detection wavelength was 231nm. Docetaxel was intravenously administrated to rat at a single dosage of 75mg/㎡.The rat were dissectted at different time points and docetaxel of hepatic tissue was determined by HPLC.RESULTS In this system，the retention times of Taxol and docetaxel were 13.7 min and 11.4min ，respectively. Docetaxel concentration presented a good linear range of 0.986～49.3mg/L.The linear regression equation Y = 1.587213X -5.959293e-002.Absolute recovery and relative recoveries were 85%to100%，80%to115%.Within-day RSDs were 12.81%、7.17%、3.11%，and the between-day RSDs were 10.61%、3. 5%、9.38%.The concentration of Docetaxel in rat liver tissue were177.7～3904.3μg/g.CONCLUSION The method is reliable ，convenient and efficient and can be applied to the determination of docetaxel concentration of rat hepatic tissue in the tissue distribution research of docetaxel.

KEYWORDS： docetaxel； hepatic tissue； HPLC

多西紫杉醇 （docetaxel ，Doc ，又名多西他赛） 是新一代紫杉烷类抗肿瘤药物。商品名为 taxotere （泰索帝） [1]。由于多西紫杉醇以t-丁氧羰基取代了紫杉醇中的苯甲酸基团，因而水溶性略大于紫杉醇。市售制剂泰索帝（Taxotere）采用Tween80增溶、乙醇助溶，将其制成一个注射剂浓缩液和一个溶剂的两瓶装。其中注射剂浓缩液为含有主药的Tween80溶液，溶剂为13%（w/w）的注射乙醇，使用时先将溶剂加入浓缩液中混合均匀，临用前再用生理盐水或5%葡萄糖注射液稀释后使用。这种使用方法操作繁琐，临床用药极不方便，并且在配制过程中容易产生二次污染，给患者的使用带来风险。为了消除现有多西紫杉醇制劑所产生的一系列问题并解决多西紫杉醇溶解度低的缺点，本课题研制了多西紫杉醇静脉注射亚微乳，以期为多西紫杉醇的新剂型开发提供研究基础。目前国内外对于多西紫杉醇在生物标本中的分析方法多采用液相色谱或液-质联用检测法。本试验采用高效液相色谱法测定大鼠肝组织中的多西紫杉醇，操作简便 [3]。

1 材料

1.1仪器

KUBOTA5922型冷冻离心机，岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪BP221S型电子分析天平，N-EVAP型氮吹仪，XW-80A旋涡混旋机，Cascada IX型超纯水仪，ETS-2型大容量高速匀浆机

1.2试剂

甲醇（Fisher 公司）、叔丁基甲醚（CNW Technologiers Gmbh公司）、生理盐水、乙腈（HPLC级，Fisher Scientific 公司）、纯化水（自制）、氮气

1.3 试药

紫杉醇对照品 （中国药品生物制品检定所。批号：100382-200301），（中国药品生物制品检定所。批号：100666-200401，含量99.3%） ， 多西他赛亚微乳注射液（批号：20100204）

1.4 实验动物

SD大鼠，雌雄兼用，体重180-220g，由新疆医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（湘）2006-0001。试验前12h禁食，随意饮水

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SymmetryShield RP18柱（5um，250×4.6mm）； 检测波长：231nm，柱温：30℃；流动相：乙腈：水=50：50；流速：1.0ml/min；进样量：20μL.

2.2 标准储备液配制

2.2.1 多西紫杉醇标准储备液

取经五氧化二磷减压干燥两小时的多西紫杉醇标准品适量，精密称定0.04930g，置于经干燥的100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用超声仪超声五分钟使其完全溶解并混匀，即得0.493mg/mL多烯紫杉醇标准溶液。量取1ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得49.3μg/mL多烯紫杉醇标准品。

2.2.2 紫杉醇内标溶液

取经五氧化二磷减压干燥三小时的紫杉醇对照品适量，精密称定0.00813g，置于经干燥的100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.0813mg/ml紫杉醇内标溶液

2.3 组织样品处理

2.3.1 组织匀浆

解剖大鼠，取肝脏组织 ，生理盐水洗净至无血色 ，滤纸吸干 ，称取肝组织样品0.3g，加入0.9%生理盐水0.9ml匀浆，直至肝组织形成匀浆，将其转移至10ml离心管中，备用。

2.3.2组织样品中多西紫杉醇的提取

采用叔丁基甲醚2次提取组织中的多西紫杉醇。量取2.7ml叔丁基甲醚分次冲洗装匀浆液的玻璃管，将冲洗液转移至相应的离心管中，涡旋震荡3min，3000r/min离心10min，用滴管移取上清液至另一只10ml玻璃离心管中，同法用叔丁基甲醚再提取一次，合并两次提取液，室温下氮气流吹干，加入0.3ml甲醇，涡旋震荡3min，用0.45um有机滤膜过滤，制成样品以待进样。

2.4 采样方法及采样时间点选择

2.4.1采样方法

SD大鼠，雌雄各半，禁食12h后尾静脉注射多西紫杉醇亚微乳注射液75mg/m2 ，给药后不同时间点5min、30min、1h、3h、5h、7h脱颈椎处死，取完整肝，用生理盐水洗净，然后用滤纸吸干，包于锡箔纸内，置-40℃冰箱内保存，待用。

2.4.2采样时间点的选择

分别在给药后5min、30min、1h、3h、5h、7h处死给药大鼠雌雄各一只，取肝组织，按供试样品处理方法处理，HPLC进样20μL分析，以多西紫杉醇峰面积为纵坐标、采样时间为横坐标作图，结果见图1

图1不同采样时间—多西紫杉醇峰面积曲线

Fig.1 Sampling time - docetaxel peak area under the curve

通过以上试验结果，选择采样点5min作为吸收相代表，30min、1h作为平衡相代表，5h作为消除相代表。

2.5 专属性试验

空白组织样品、空白肝组织匀浆中加入紫杉醇对照品、空白肝组织匀浆中加入多西紫杉醇对照品、给药后大鼠肝组织样品色谱图见图。由图可见 ，在所建立的色谱条件下 ，肝组织匀浆液中成分不干扰多西紫杉醇与内标紫杉醇的测定。多西紫杉醇与内标紫杉醇分离良好，保留时间分别为11.4min、13.7min左右。

2.6标准曲线绘制

取6只空白大鼠肝组织匀浆液 6 管 ，每管中均加入多西紫杉醇标准储备液和内标紫杉醇标准储备液 将肝组织匀浆稀释成多西紫杉醇系列质量浓度为0.986 mg/L、4.930 mg/L、9.860 mg/L、16.433 mg/L、32.867 mg/L、98.600 mg/L，每管均加入内标紫杉醇标准储备液 50μL，作为标准曲线溶液 ，按“2. 3” 方法处理样品并测定，以多西紫杉醇与紫杉醇峰面积比为横坐标（X），多西紫杉醇与紫杉醇浓度比为纵坐标（Y），1/C2为加权系数进行线性回归，得肝组织标准曲线方程，结果Y = 1.549142X-3.502753e-002 R2 = 0.9985

2.7 精密度与相对回收率试验

取空白肝组织0.3g匀浆 ， 各加入不同体积的多西紫杉醇标准储备液和相同体积的内标紫杉醇溶液，分别配成多西紫杉醇质量浓度为0.986，4.93，49.3 mg/L低、中、高 3 个浓度含药组织匀漿各6份样品。按前述组织样品处理方法处理，进样20ul，连续进样三天。由标准曲线计算各样品的的浓度，以测定值与实际值之比计算相对回收率、日内、日间精密度。结果见表1

表1肝组织中多西紫杉醇精密度试验 （n=6）

Table 1 docetaxel precision of liver tissue （n = 6）

2.8 提取回收率试验

取空白肝组织0.3g匀浆 ， 各加入不同体积的多西紫杉醇标准储备液和内标紫杉醇溶液，分别配成含药组织匀浆样品。按样品处理方法平行处理，使供试样品多西紫杉醇质量浓度为0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 个浓度各6份，进样20μL分析，记录多西紫杉醇峰、紫杉醇面积A1、B1，另取不同体积的多西紫杉醇标准溶液分别加入生理盐水0.9ml，按样品处理方法平行处理，使供试样品多西紫杉醇质量浓度为0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 个浓度各6份，进样20μL分析，记录多西紫杉醇、紫杉醇峰面积A2、B2。以R=A1/A2×100%计算肝组织中多西紫杉醇的提取回收率R，同法计算紫杉醇提取回收率。结果见表2

2.9 稳定性试验

2.9.1 室温放置24h稳定性考察 取空白肝组织0.3g匀浆 ， 各加入不同体积的多西紫杉醇标准储备液和内标紫杉醇溶液，分别配成含药组织匀浆样品。按样品处理方法平行处理，使供试样品多西紫杉醇质量浓度为0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 个浓度各6份。室温放置24h后，进样分析，实测浓度的RSD值分别为5.70%、2.18%、4.70%，证明供试样品24h内稳定。

2.9.2 冻融3个循环后稳定性考察 取空白肝组织0.3g匀浆 ， 各加入不同体积的多西紫杉醇标准储备液和内标紫杉醇溶液，分别配成含药组织匀浆样品。使供試样品多西紫杉醇质量浓度为0.986，4.93，49.300 mg/L低、中、高 3 个浓度各6份。各样品中加入内标溶液50ul，置-40℃冰箱内放置，反复冻融三次，按前述组织样品处理和测定方法操作，计算其浓度 ， 结果其RSD 值为11.92%、7.54%、9.86%，证明样品冻融3各循环后是稳定的。

2.10 大鼠肝组织中药物浓度

2.10.1 给药方法

大鼠尾静脉注射给予多西紫杉醇亚微乳，剂量为75mg/m2 ，给药前禁食，自由饮水，分别于给药后5min、30min、1h、5h处死动物，解剖后取肝组织待测。

2.10.2 给药5min、30min、1h、5h后肝组织中多西紫杉醇浓度

为验证本试验所建立的肝组织匀浆中多西紫杉醇浓度测定方法是否可实际应用于测定大鼠尾静脉给药后分布至肝脏中的药物 ， 因此分别取给药5min、30min、1h、5h 后 大鼠肝组织，制成匀浆，按前述组织样品处理和测定方法操作，测定其中多西紫杉醇质量浓度为，结果如下表

表3 样品含量测定（n=6）

Table 3 content of the sample was measured （n = 6）

3.讨论

对于生物样本中多西紫杉醇的检测 ， 有文献报道流动相采用0.02 mol/L 醋酸铵溶液 （pH 4.5）乙腈 （60∶40 ）或磷酸盐缓冲液 （30 mmol/L ，pH3） 乙腈 （47∶53）。亦有文献报道采用别的流动相，但不利于内标紫杉醇和多西紫杉醇的分离。流动相中有机溶剂乙腈容积比例的增减对多西紫杉醇的保留时间有较大的影响[6]。 本试验采用乙腈-水（50∶50） 作为流动相 ， 可使内标紫杉醇和多西紫杉醇的保留时间分别在11.4min 和 13.7min 左右 ，分离较为理想。

内标物的选择 ， 由于紫杉醇与多西紫杉醇的出峰位置相近且能分离良好 ，对测定没有干扰 ， 且紫杉醇的水溶液在-40 ℃冰箱中放置较长时间亦很稳定 ，所以用紫杉醇作为内标稳定、可靠。

本试验采用叔丁基甲醚提取肝组织匀浆中多西紫杉醇 ，快速混合 2 次提取 ，能有效提取多西紫杉醇并减少了其他物质干扰 ，提取回收率较高 ，基线平稳 ，杂质峰少 ，分析时间适中。

多西紫杉醇属强亲脂性物质 ，在水中溶解度极低 ，在甲醇、乙腈等有机溶剂中溶解较好 ，但室温和光线会加速其分解 ，因此其提取需在避光条件下进行 ，低温冷冻可保存较长时间。

由大鼠尾静脉给予多西紫杉醇经不同时间段测定分布至肝脏中的药物浓度结果表明：本试验所建立的方法学可用于药物在动物肝组织中的测定 。

参考文献：

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