全缘栝楼多糖及提取物不同极性部位抗氧化研究

潘乔丹，唐海燕，黄元河，韦贤，李巨宝，李雄富

（右江民族医学院，广西百色533000）

全缘栝楼多糖及提取物不同极性部位抗氧化研究

潘乔丹，唐海燕，黄元河*，韦贤，李巨宝，李雄富

（右江民族医学院，广西百色533000）

研究全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位体外抗氧化活性。采用清除羟自由基（OH·）、［2，2＇-连氨-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二氨盐］自由基（ABTS+·）、DPPH测定法以及Fe3+还原/抗氧化能力（FRAP）法，评价全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位的抗氧化能力。全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位清除DPPH·能力均强于抗坏血酸（IC50= 1.22 mg/mL），且多糖（IC50=0.030 mg/mL）和乙酸乙酯层（IC50=0.082 mg/mL）比茶多酚强（IC50=0.118 mg/mL）；多糖（IC50=0.031 mg/mL）清除OH·能力比茶多酚（IC50=0.032 mg/mL）和抗坏血酸（IC50=0.044 mg/mL）强，而石油醚层（IC50=0.033 mg/mL）和乙酸乙酯层（IC50=0.038mg/mL）强于抗坏血酸；清除ABTS+·能力均强于茶多酚（IC50=0.416mg/mL），且多糖（IC50=0.008 mg/mL）强于抗坏血酸（IC50=0.011 mg/mL）；Fe3+还原/抗氧化能力均强于茶多酚（FRAP= 1 310.8 μmol/g），但比抗坏血酸弱（FRAP=31 469 μmol/g）。全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位有较强的抗氧化能力，为其生物活性的深入研究提供了参考依据。

全缘栝楼；多糖；不同极性部位；抗氧化

全缘栝楼（Trichosanthes ovigera Bl.）为栝楼属植物，据《广西药用植物名录》记载，全缘栝楼根具有清热解毒、利水、去瘀的功效，用于治疗跌打骨折、痈疮肿毒；其果皮和种子用于治肺热咳嗽、便秘、咽喉痛、痈疮肿毒。还具有抗艾滋病病毒的作用［1］，在民间作为野生水果食用。人们对全缘栝楼抗氧化方面的研究较少。本研究采用四种体外抗氧化方法研究全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位的抗氧化活性，为全缘栝楼进一步综合开发利用提供依据。

1仪器、试剂、样品

1.1仪器

DF-15台式连续投料粉碎机：温岭市林大机械有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HHS-21-4电热式恒温水浴锅：江苏金坛宏凯仪器厂；TU-1800紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FA1104型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器。

1.2药材

全缘栝楼（Trichosanthes ovigera Bl.）采于广西百色。实验用其果实，干燥后粉碎成粉末。

1.3试剂

葡萄糖标准品（J＆K CHEMICAL LTD）、三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine，TPTZ，Aladdin）、2，2＇-连氨-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二氨盐（ABTS，生工生物公司）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH，上海楷洋生物技术有限公司）、抗坏血酸（天津博迪化工股份有限公司）、茶多酚（广州食品添加剂公司）；其它试剂均为分析纯。

2方法

2.1多糖的提取和含量测定

称取全缘栝楼粉50.0 g，经石油醚（60℃～90℃）回流脱脂两次，1.0 h/次。再用95%乙醇回流提取两次，2 h/次，以除去单糖和低聚糖，将药渣烘干备用。将已处理好的药渣加蒸馏水用超声波（100 W）提取3次，每次2 h。合并提取液浓缩后经醇沉、除蛋白后浓缩至干，得精多糖样品4.750 g。称取全缘栝楼多糖0.100 0 g，加蒸馏水配制成2.0 g/L的母液，再稀释成不同浓度的溶液备用。

以葡萄糖为标准对照品，配制不同浓度梯度，采用苯酚-硫酸法［2］，首先在300 nm～900 nm波长扫描，最后确定在490 nm处测定吸光度。以吸光度A与浓度C进行直线回归，A=20.67C-0.076 8（r=0.999 5），线性范围为0.01 mg/mL～0.05 mg/mL。由回归方程计算全缘栝楼多糖的含量，多糖含量计算公式：

多糖含量（mg/g）=多糖质量（mg）/原料质量（g）

2.2不同极性部位的提取

称取全缘栝楼粉50.0 g，用250 mL 95%乙醇于超声波仪中提取3次，每次2 h。合并提取液浓缩干燥得总提取物（EE）12.95 g；将总提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩干燥得石油醚层（PEE）6.71 g、乙酸乙酯层（EAE）0.42 g、正丁醇层（BE）2.56 g和水层（WE）2.42 g的不同极性部位。取各不同极性部位样品各0.05 g，用80%乙醇稀释至0.050 mg/mL的溶液备用。并各不同极性部位备用液用80%乙醇逐级稀释成浓度为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL的受试溶液。

2.3抗氧化测定

2.3.1DPPH清除率的测定

参照Kim［3］等和霍丽妮［4］等方法，取2.0 mL样品溶液，加入0.4 mmol/L DPPH·溶液2.0 mL，避光30 min后于515 nm处测吸光值。通过下式计算对DPPH的清除率：

式中：A0为溶剂代替样品的吸光度；A1为样品的吸光度；A1′为无水乙醇代替DPPH的空白对照组。

2.3.2清除羟自由基（OH·）能力的测定（水杨酸法）

利用Fenton反应法［5-6］。分别移取不同浓度的溶液2.0 mL于试管中，加入1.0×10-2mol/L FeSO41.0 mL，1.0×10-2mol/L水杨酸-乙醇溶液2.0 mL，最后加入30% H2O22.0 mL启动反应，于室温下反应1 h。以蒸馏水调零，测λ510样品的吸光度。考虑到试剂与提取物溶液的协同增色效应，以蒸馏水2.0 mL替代30%H2O22.0 mL，其它试剂与样品组相同。每份样品平行操作3次，取均值，计算公式为：

式中：A0为溶剂代替样品液的吸光度；A1为样品组的吸光度；A1′为蒸馏水代替H2O2的空白对照组吸光度。

2.3.3清除ABTS+自由基能力的测定（ABTS法）

参考Re等［7］的方法，分别移取不同浓度的溶液2.0 mL于试管中，各试管中加入4.0 mL ABTS+·测定液，振荡30 s，测定在734 nm波长处的吸光度，每份样品平行操作3次，取均值，计算公式为：

式中：A0为ABTS+·测定液的吸光度；A1为样品组的吸光度。

2.3.4总抗氧化能力的测定（FRAP法）

参照Orhan［8］和章英等［9］的方法，分别移取不同浓度的溶液2.0 mL于试管中，加入2.0 mLFRAP工作液，于593 nm处测吸光度A，各组实验均做3次平行，取均值。结果均以FeSO4当量（即每克样品的总抗氧化能力相当于FeSO4的微摩尔数）表示。

2.3.5半清除率浓度计算

根据回归方程计算清除率为50%时的浓度（IC50，mg/mL）。

3结果与讨论

3.1多糖含量的测定

根据葡萄糖标准溶液的回归方程，计算出全缘栝楼多糖含量为92.748 mg/g。

3.2清除DPPH自由基作用

清除DPPH自由基IC50值见表1。

表1　全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位的抗氧化活性Table 1Antioxidant activity of polysaccharides and different polarity parts of extract from Trichosanthes ovigera Bl.

从表1可以看出，全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位具有一定的清除DPPH自由基的能力，由IC50与清除能力大小成负相关，即IC50越小则清除能力越强的关系，得出清除DPPH自由基能力依次为：多糖＞乙酸乙酯层＞茶多酚＞正丁醇层＞总提取物＞水层＞石油醚层＞抗坏血酸。可见，多糖和不同极性部位清除DPPH自由基的能力都强于抗坏血酸，多糖和乙酸乙酯层的清除DPPH自由基的能力强于茶多酚。

3.3清除羟自由基作用

清除羟自由基作用及IC50值见图1、表1。

图1　全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位清除羟自由基作用Fig.1Effect of scavenging OH·of polysaccharides and different polarity parts of extract from Trichosanthes ovigera Bl.

由图1可以看出，全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位对OH·自由基都表现出较高的清除能力，并在实验浓度范围内呈明显的量效关系，随着浓度的增加，清除率也是增高的。水层、正丁醇层清除率曲线相对平缓，石油醚层清除率递增趋势相对明显，乙酸乙酯层次之，由表1的半清除率浓度IC50值及其与清除能力大小成负相关的关系，可知对OH·自由基的清除能力顺序为：多糖＞茶多酚＞石油醚层＞乙酸乙酯层＞抗坏血酸＞总提取物＞水层＞正丁醇层。可见，多糖、石油醚层和乙酸乙酯层对OH·自由基的清除能力强于抗坏血酸，且多糖强于茶多酚。

3.4清除ABTS+自由基作用

清除ABTS+自由基作用及IC50值见图2、表1。

图2　全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位清除ABTS+自由基作用Fig.2Effect of scavenging ABTS+·of polysaccharides and different polarity parts of extract from Trichosanthes ovigera Bl.

由图2可以看出，全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位对ABTS+自由基都有一定程度的清除能力。乙酸乙酯层的清除率和浓度呈较明显的递增关系，正丁醇次之，石油醚的最不明显。由表1的半清除率浓度IC50值大小及其与清除能力大小成负相关的关系，可知对ABTS+自由基的清除能力顺序为：多糖＞抗坏血酸＞乙酸乙酯层＞正丁醇层＞总提取物＞水层＞石油醚层＞茶多酚。由此可见，清除ABTS+自由基的能力中，多糖和提取物不同极性部位均强于茶多酚，且多糖强于抗坏血酸。

3.5总抗氧化能力的测定

在593 nm处，FeSO4浓度Y与吸光度X在一定范围内呈线性剂量关系，线性回归方程为：Y=0.000 5X-0.009 9（r=0.998 9）。根据反应后的吸光度值A，在标准曲线上求得相应的FeSO4当量（μmol/g）。表1所示，对Fe3+的还原能力顺序为：抗坏血酸＞正丁醇层＞水层＞多糖＞总提取物＞乙酸乙酯层＞石油醚层＞茶多酚。可见，多糖和不同极性部位的Fe3+还原/抗氧化能力均弱于抗坏血酸，强于茶多酚。

4结论

从日前研究结果揭示的证据表明自由基几乎和人类大部分常见的几种主要疾病都有关系，从人类死亡率最高的心脑血管疾病，到人类最可怕的癌症，无一不和自由基有着密切关系［10-11］。寻找安全、有效的天然自由基清除剂已成为当前研究的热题。本文采用DPPH法、水杨酸法、ABTS法和FRAP法对全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位进行体外抗氧化活性研究，通过比较清除DPPH·、OH·、ABTS+·的IC50值和FRAP当量大小判断其对DPPH·、OH·、ABTS+·的清除能力和对Fe3+的还原/抗氧化能力，并与抗坏血酸和茶多酚两种常用的抗氧化剂相比较。通过比较各IC50值或FRAP当量值，提取物不同极性部位清除DPPH能力均强于抗坏血酸，但比茶多酚弱（除乙酸乙酯层外）；清除OH·能力均比茶多酚弱，而石油醚层和乙酸乙酯层强于抗坏血酸；清除ABTS+·和Fe3+还原/抗氧化能力均比抗坏血酸弱，强于茶多酚；而全缘栝楼多糖清除DPPH·、OH·、ABTS+·的能力均强于茶多酚和抗坏血酸；说明，全缘栝楼多糖和提取物不同极性部位具有较强的抗氧化能力，尤其是多糖。这一研究为全缘栝楼的进一步研究以及开发、应用提供了科学依据。

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Antioxidant Activity of Polysaccharides and Different Polarity Chemical Fractions of Extract from Trichosanthes ovigera Bl.

PAN Qiao-dan，TANG Hai-yan，HUANG Yuan-he*，WEI Xian，LI Ju-bao，LI Xiong-fu
（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

To study the antioxidant activity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera.The antioxidant activities of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera were evaluated by DPPH free radical scavening assay，and hydroxyl free radical（OH·）scavenging assay，and［2，2＇-Azino-bis（3-ethylbenzo thia zoline-6-sulfonic acid）］diammonium salt radical（ABTS+·）and ferric reducing antioxidant power（FRAP）assay.DPPH free radical scavening activity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera were higher than VC（IC501.22 mg/mL），and polysaccharides（IC500.030 mg/mL）and ethylacetate fraction（IC500.082 mg/mL）were higher than tea polyphenol（IC500.118 mg/mL）.OH·scavenging activity of polysaccharides（IC500.031 mg/mL）were higher than tea polyphenol（IC500.032 mg/mL）and VC（IC500.044 mg/mL），and petroleum ether（IC500.033 mg/mL）and ethylacetate fraction（IC500.038 mg/mL）were higher than VC.ABTS+·scavenging activity and ferric reducing antioxidant capacity of polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract were higher than tea polyphenol were higher than tea polyphenol（IC500.416 mg/mL，FRAP 1 310.8μmol/g），and ABTS+·scavenging activity of polysaccharides（IC500.008 mg/mL）higher than VC（IC500.011 mg/mL）.Polysaccharides and different polarity chemical fractions of extract from Trichosanthes ovigera had strong antioxidative activity，this conclusion would provide important evidences for the further study of the bioactivity.

Trichosanthes ovigera Bl；polysaccharides；different polarity chemical fractions；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.001

2014-01-22

广西区中医药管理局项目（gzzc1181）；中医药公共卫生专项“国家基本药物所需中药原料资源调查和监测项目（财社［2011］76号）；中医药行业科研专项”我国代表性区域特色中药资源保护利用”（201207002）

潘乔丹（1980—），女（汉），讲师，硕士，从事天然产物化学研究。

黄元河（1979—），男（壮），讲师，硕士，从事中药资源研究。