胃腺癌组织维生素D3上调蛋白1表达与核因子-资B活性关系研究

刘荣火　周　宇　郭中秋　谢丽华　陈晓红　胡红松　俞红华

胃腺癌组织维生素D3上调蛋白1表达与核因子-资B活性关系研究

刘荣火1周宇2郭中秋1谢丽华1陈晓红1胡红松1俞红华1

目的探讨胃腺癌组织维生素D3上调蛋白1（VDUP1）表达情况及其与核因子-资B（NF-资B）活性关系。方法分别取胃腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织，病理检查确诊，凝胶迁移率变动分析（EMSA）测NF-资B活性，RT-PCR检查VDUP1表达。结果胃腺癌组织的NF-资B活性（10 701.0 ±3 529.4）与癌旁组织（7 961.5±1601.2）比较，差异有显著性（P＜0.01）；胃腺癌组织VDUP1表达减少，与癌旁组织VUDP1表达情况比较，差异有显著性（P＜0.01）。结论胃腺癌组织VDUP1表达降低，NF-资B活性升高，VDUP1表达与NF-资B活性呈负相关。VDUP1对NF-资B活性可能具有负调节作用。

胃腺癌；维生素D3上调蛋白1；核因子-资B

胃腺癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率高且早期诊断存在困难，中晚期患者治疗效果欠理想，给患者家庭及社会带来沉重的负担。NF-资B是一种核蛋白因子，在生物体生长、凋亡和分化等过程中起非常重要的作用，不少研究认为NF-资B是胃腺癌发生的关键机制之一。维生素D3上调蛋白1（Thioredoxin binding protein/vitamin D3upregulated protein 1，VDUP1）能与抗氧化剂硫氧还蛋白相互作用，对细胞周期产生影响，与多种肿瘤的发生发展相关，在多种肿瘤组织中它的表达显著减少，是一个候选肿瘤抑制基因，是目前的研究热点。本文拟对胃腺癌组织中VDUP1表达情况及其与NF-资B活性的关系进行研究。

材料与方法

一、病人资料与主要材料

病例来源于2013年7月至2015年6月在我院消化内科及消化内镜中心就诊的患者。遵循知情同意原则，胃腺癌组25例（男17例、女8例，中位年龄63.4岁）；实验所用的胃腺癌病例的诊断、分期等标准采用2010年第3版日本《胃癌治疗指南》。取部分镜下典型病例患者癌旁组织10例（男7例、女3例，平均年龄61.7岁），EMSA试剂盒（promega公司）；［γ-32p］ATP（5 000 Ci/mmol，10 mCi/ml，北京福瑞）；Trizol RNA抽提试剂及RT（逆转录）试剂盒（由invitrogen公司提供）。

二、标本选取

标本来源于胃镜检查和活检，先钳取癌旁组织，后钳取肿瘤病灶；病理诊断为胃腺癌者进入实验组，癌旁组织取标本作为对照组。

三、EMSA法检测NF-资B活性

按下列顺序进行：①提取及定量核蛋白；②探针标记纯化；③4%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制；④结合反应；⑤0.5 X TBE电泳液，恒压180 V电泳90 min。剥离胶片，电灯烤干，磷屏曝光20 h。同位素成像分析系统活性值（灰度值）。

四、RT-PCR法检测VUDP1表达

按Trizol试剂盒和RT-PCR试剂盒说明书步骤操作抽提总RAN和RT-PCR检测。引物设计参考文献［1］。VUDP1：扩增产物长度为236 bp，上游引物5′-GCA ATC ATA TT A TCT CAG GGA C-3′，下游引物5′-CAT CTC AGA GCT GGT TCG-3′。β-actin：扩增产物长度为393 bp，β-actin上游引物5′-GAA ATC GTG CGT GAC AAT AA-3′，β-actin下游引物5′-GTA CTT GCG CTC AGG AGG-3′。PCR反应总体积50滋L，先反转录，温度42℃，时间60 min；合成的cDNA，同时扩增β-actin和VDUPl，94℃30 s，50．5℃60 s，72℃60 s，35个循环。反应结束后取10滋L RT-PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，电泳结果用Band Scan 5.0软件进行光密度积分值分析，计算出VDUPl与内参照βactin的光密度积分值之比作为VDUPl mRNA表达相对含量值（灰度比）。

五、统计学分析

采用SAS 8.1统计分析软件；所有参数用x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

结果

一、各段组织NF-资B活性比较

胃腺癌组织的NF-资B活性显著增强，与癌旁组织比较，差异有显著性（P＜0.01），见表1和图1。

表1　各组胃黏膜组织NF-资B活性比较

表1　各组胃黏膜组织NF-资B活性比较

注：△与胃腺癌组比较，差异有显著性（P＜0.01）。

组别n活性值癌旁组织10　7961.5±1601.2△胃腺癌组2510701.0±3529.4

图1　两组胃黏膜NF-κB活性

二、胃腺癌组织和癌旁组织VDUP1mRNA表达情况见图2。

图2　两组VDUP1 mRNA的表达情况

讨论

硫氧还蛋白（Trx）是一种强力抗氧化剂，在细胞增殖、凋亡、基因表达和癌细胞活动等过程中扮演多重角色。Trx还能抑制细胞凋亡信号调节激酶-1（ASK-1），具有抗细胞凋亡或细胞死亡因子的功能。还有研究认为Trx可改变与DNA结合的转录因子如NF-κB、AP-1、TF-KC、糖皮质激素受体和BZLF1等。Trx在肺癌、子宫颈癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等癌症组织中表达增高，并且表达水平与肿瘤生长呈正相关。多种癌细胞分泌Trx，诱导其自身生长。此外，Trx还与抗癌药物的耐药性有关。VDUP1又称为硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein，TXNIP）或硫氧还蛋白结合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2），是一种多功能的46-kDa蛋白，除了参与多种氧化应激反应，还具有多种生物学功能，是Trx内源性抑制因子。VDUP1与Trx活性区的两个半胱氨酸残基结合，抑制Trx的活性，VDUP1高表达时Trx活性降低近50%。VDUP1与Trx相互作用可抑制Trx的还原活性，阻止Trx与其它因子如ASK-1和PAG的相互作用；从而使细胞对氧化应激变得脆弱。VDUP1表达增加还会竞争性抑制Trx与ASK-1的结合，从而使ASK-1从Trx分离，ASK-l得到活化，最终导致细胞凋亡。PAG又称过氧化物酶1，它是硫醇基特异性抗氧化剂，可以抑制细胞凋亡、促进细胞繁殖。当细胞中存在Trx时，PAG作为中间电子供体还原HO2。但当细胞中VDUP1高表达时，PAG与Trx之间的作用减少近60%，此时细胞易受氧化应激损伤而发生凋亡。另外，VDUP1的异位表达抑制肿瘤细胞生长和细胞周期进程。VDUP1表达增高时，细胞周期停滞，肿瘤细胞繁殖受到抑制。研究发现VDUP1在人类许多肿瘤如乳腺癌、胃肠癌、肾细胞癌和恶性嗜铬细胞瘤、人类T细胞白血病和高级别的B细胞淋巴瘤的的表达水平降低［2］。因此，它已成为近年肿瘤研究的重要靶点。

NF-κB是炎症的中心环节，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。有研究发现一过性炎性信号通过一个正反馈环路包括NF-κB、Lin28、let-7和IL-6可以启动一个从非转化为癌细胞的开关。还有研究发现炎症因子IL-6激活转录因子STAT3，STAT3通过直接激活miR-21和miR-181b-1起到抑制PTEN与CYLD肿瘤抑制基因作用，从而增加维持转化状态所需的NF-κB活性［3］。胱天蛋白酶相关募集域6（Caspase-associated recruitment domain 6（CARD6））作为一种由RIP1、RIP2、Bcl-10和MEKK诱发后能激活NF-κB信号传导的蛋白质，在胃腺癌、结肠腺癌中呈高表达［4］。不少研究［5-6］发现胃腺癌组织的NF-κB活性较正常组织显著升高。活化的NF-κB能通过调节c-myc、cyclinD1、bcl-xl、基质金属蛋白酶（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）和Ku蛋白等多种途径［7-8］参与胃腺癌的发生。VUDP1作为候选肿瘤抑制基因，具有通过多种途径调节NF-κB的作用。如Kwon HJ等［9］发现，VDUP1抑制TNF-α和p65蛋白诱导的NF-κB活化，VDUP1丧失促进TNF-α诱导的NF-κB活化，而TNF-α能下调VDUP1表达。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）通过结合到NF-κB的p50或p65亚基抑制NF-κB活性，VDUP1能协同HDAC1和HDAC3抑制p65的诱导的NF-κB活化。此外，VDUP1还通过调节NF-κB活性，与不同的细胞周期调控相关联，抑制细胞增殖。有研究发现VDUP1表达降低大大增加NF-κB活性。而细胞周期蛋白D1是NF-κB的最重要的转录靶，NF-κB的活性增加是增加细胞增殖的原因之一。研究认为VDUP1在控制肝细胞再生的启动中起一定作用［7］，VDUP1缺陷的肿瘤细胞增殖增加，VDUP1丧失促进肝癌发生［9］。本研究发现，胃腺癌组织的VUDP1表达较癌旁组织显著降低，相应的胃腺癌组织的NF-κB活性较癌旁组织显著升高，与目前研究结果有一致性［8］。提示在胃腺癌组织中的VUDP1表达降低，且其与NF-κB活性存在负相关。鉴于活检标本体积存在一定的差异，且深圳地区不少患者诊断肿瘤后回当地医院治疗等特殊情况，对患者的肿瘤浸润、转移等情况的诊断等存在困难与不足，在未来的工作中需要进一步调整研究方案。

1高枫，蔡绍曦，邹飞，等.硫氧还蛋白结合蛋白-2/维生素D3上调蛋白1在哮喘病人外周血嗜酸性粒细胞的表达.南方医科大学学报，2006，26（4）：371-375.

2党英男，刘晓慧，白洁.硫氧还蛋白结合蛋白-2与肿瘤的关系.中国老年学杂志，2010，30（22）：3414-3416.

3Iliopoulos D，Jaeger SA，Hirsch HA，et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer.Mol Cell，2010，39（4）：493-506.

4Kim SS，Ahn CH，Kang MR，et al.Expression of CARD6，an NF-kappaB activator，in gastric，colorectal and oesophageal cancers. Pathology，2010，42（1）：50-53.

5Skrzycki M，Scibior-Bentkowska D，Podsiad M，et al.Protein level of transcription factors AP-1 and NF-κB in selected human gastrointestinal tract tumors.Pol Merkur Lekarski，2008，25（150）：510-515.

6刘荣火，周宇，胡红松，等.H.pylor相关性萎缩性胃炎和胃腺癌的核因子-kB活性相关性研究.实用医学杂志，2012，28（22）：3718-3720.

7Kwon HJ1，Hong SK，Yoon WK，et al.Vitamin D3 up-regulated protein 1 controls the priming phase of liver regeneration.J Vet Sci，2013，14（3）：257-262.

8Woolston CM，Madhusudan S，Soomro IN，et al.Thioredoxin interacting protein and its association with clinical outcome in gastrooesophageal adenocarcinoma.Redox Biol，2013，1：285-291.

9Kwon HJ，Won YS，Suh HW，et al.Vitamin D3 upregulated protein 1 suppresses TNF-α-induced NF-κB activation in hepatocarcinogenesis.J Immunol，2010，185（7）：3980-3989.

2015-02-09）

（本文编辑：肖冰）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.042

1 518172深圳市龙岗区人民医院消化内科；2 524001广东医学院附属医院消化内科

胡红松，E-mail：szhhs2010@163.com