Kiss-1和MMP-9在结直肠癌中的表达及临床意义

江毅敏　戴俊臣　王　俊　王显飞　冯志松　贺国斌任　权

Kiss-1和MMP-9在结直肠癌中的表达及临床意义

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目的探讨Kiss-1 mRNA和蛋白在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理学特征的关系。方法选择110例大肠癌和距瘤体5 cm以上的正常结直肠组织，用Realtime PCR检测肠黏膜Kiss-1 mRNA和MMP9 mRNA的表达，用免疫组织化学和蛋白免疫印迹检测Kiss-1和MMP9蛋白的表达。结果结直肠癌组织中Kiss-1 mRNA表达水平显著低于癌旁组织；结直肠癌组织中MMP9 mRNA表达水平显著高于癌旁组织（P=0.001）。Kiss-1蛋白在结直肠肿瘤组织中的阳性表达显著低于癌旁组织（P＜0.05）；结直肠癌组织中MMP9蛋白表达显著高于癌旁组织（P＜0.05）。KISS-1表达与结直肠肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关（P＜0.05）。结论Kiss-1蛋白表达缺失与大肠癌的浸润和转移有关可做为大肠癌转移的预测因子及大肠癌的治疗靶点，对于结直肠癌的防治具有重要的临床意义。

结直肠癌；Kiss-1；MMP-9；淋巴结转移

大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，其原因主要是大肠癌患者早期可无症状或早期症状不明显，肿瘤局部复发及远处转移发生率较高［1］，因此如何早期发现和抑制肿瘤的复发和转移是影响患者预后的重要因素。定期结肠镜检查有益于防治早期大肠癌。而Kiss-1基因是新近发现的重要的肿瘤转移抑制基因。本研究通过检测大肠癌组织、癌旁组织（距肿瘤5 cm）肠黏膜组织中Kiss-1基因及其蛋白表达，并分析其与结直肠癌临床病理学特征的关系及临床意义。

资料与方法

一、临床资料和主要试剂

收集川北医学院附属医院胃肠外科2013年3月至2014年12月手术切除的110例新鲜结直肠癌瘤体及距瘤体5 cm以上的正常结直肠组织标本，液氮保存。入选病例术前均经肠镜检查及活检的病理确诊且未行放、化疗。年龄20～75岁，平均年龄（55.46±9.86）岁；其中男性57例，女性53例；淋巴结转移43例，无淋巴结转移58例；远处转移9例。主要试剂：实时荧光定量PCR（Realtime PCR）试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，Kiss-1基因引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司设计及合成，见表1。Kiss-1多克隆杭体购于美国abcam公司。

表1　Kiss-1 Real-time PCR引物序列、扩增片段长度及退火温度

二、Real-time PCR检测肠黏膜Kiss-1 mRNA表达

应用Trizol法提取组织RNA，用紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，取A260/A280比值为1.9～2.2的样品，按照说明书逆转录为cDNA，－20℃保存。反应体系25 μL（cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，2x SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，dH2O 8.5 μL）。反应程序：95℃、10 s，95℃、5 s，60℃、20 s，40个循环。每个样品均设3个复孔。取3份正常结直肠组织总RNA等体积混合作为正常对照样品。用相对定量方法计算Kiss-1基因mRNA的表达量。公式：RQ=2-△△Ct，△△Ct=△Ct待测－△Ct正常=（Ct待测－Ctβ-actin）－（Ct正常－Ctβ-actin）。

三、免疫组化检测肠黏膜Kiss-1蛋白表达

抗Kiss-1抗体购自Santa Cruz公司，抗MMP-9抗体购自Abnova公司。石蜡切片脱蜡和水化，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，常规封闭后滴加一抗，4℃孵育过夜。PBS振荡清洗后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶常规封片。采用双盲法观察切片，半定量积分法判断免疫组化结果［2］：凡肠黏膜腺体细胞浆着色者为阳性，根据染色强度和显色细胞的比例进行综合评分。每张切片随机选取8个高倍视野（400倍）进行评分。①按组织显色深浅评分：无显色者为0分，呈浅黄色或黄色者为1分，呈棕黄色者为2分，呈棕褐色者为3分，求出8个视野的平均分。②以细胞着色比例分级为：＜25%的细胞着色，计0.1分；26%～50%的细胞着色，计0.4分；51%～75%的细胞着色，计0.6分；76%～100%的细胞着色，计0.9分；求出8个视野的平均分。③每张切片的积分为①×②。

图1　免疫组化检测

四、蛋白免疫印迹（Western blotting）检测肠黏膜Kiss-1蛋白表达

检测提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定浓度，以80 μg总蛋白上样，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，10%分离胶）分离电泳，溴酚兰到达分离胶底部时终止电泳。20 mA恒流条件转膜1 h，使蛋白转移至0.1 nm的NC膜上，膜在5%脱脂奶粉溶液中常温孵育2 h以封闭非特异性抗原，TBST清洗，加入一抗（1：200兔抗人Kiss-1多克隆抗体），4℃孵育过夜。TBST清洗，加入二抗（1：500羊抗兔IgG），常温孵育2 h。TBST清洗后用化学发光法进行显影曝光，用GIS1000软件分析系统量化分析。蛋白表达量=Kiss-1灰度值/β-actin灰度值。

五、统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件，数据以x±s表示，采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、Real-time PCR结果

结直肠癌组织中Kiss-1 mRNA表达水平（0.242±0.13）显著低于癌旁组织（0.573±0.41），P=0.035；结直肠癌组织中MMP9 mRNA表达水平（0.651±0.36）显著高于癌旁组织（0.189±0.41），P=0.001。

二、免疫组化结果

正常结直肠组织中Kiss-1免疫组化积分最高。Kiss-1蛋白在结直肠肿瘤组织中的阳性表达显著低于癌旁组织（P =0.043）；癌旁组织中MMP9表达量很低，结直肠癌组织中MMP9阳性表达显著高于癌旁组织（P=0.035），见图1。

三、蛋白免疫印迹结果

正常结直肠组织中Kiss-1蛋白表达最高。Kiss-1蛋白在结直肠肿瘤组织中的阳性表达显著低于癌旁组织（P= 0.039）；结直肠癌组织中MMP9阳性表达显著高于癌旁组织（P=0.001），见图2。

图2　蛋白免疫印迹检测

四、Kiss-1与结直肠肿瘤临床特征的关系

Kiss-1mRNA及蛋白表达情况与结直肠肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关（P＜0.05），见表2。

讨论

Kiss-1［3］基因是一个新的肿瘤转移抑制基因，于1997年在黑色素瘤中被Lee等人首次发现。KiSS-1在包括心脏、肝脏、肾脏和胰腺等多种正常组织中表达，而在多种存在转移的肿瘤组织中表达缺失，表明它是一个肿瘤转移抑制基因，与肿瘤的转移密切相关［4］。Lee等［5］研究表明：Kiss-1基因不影响成瘤特性，但能够抑制95%的肿瘤转移。先后有报道Kiss-1基因在乳腺癌、甲状腺乳头状癌、前列腺癌等肿瘤中有抑制肿瘤转移的作用，并在判断肿瘤患者预后上具有一定的价值［6-7］。何进等［8］报道Kiss-1基因表达与胃癌浸润深度及其淋巴结转移呈负相关。但目前国内外关于Kiss-1基因在大肠癌中的表达情况的报道较少。本研究表明：KISS-1 mRNA及蛋白表达一致，其在结直肠癌组织中的表达显著低于正常结直肠组织（P＜0.05）。KISS-1表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤发生部位、肿瘤大小无明显关系（P＞0.05），但与结直肠肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关（P＜0.05），即高分化肿瘤、浸润深，有淋巴结转移及远处转移者Kiss-1表达较高。

表2　不同临床病理特征结直肠癌患者Kiss-1基因mRNA及蛋白表达水平

基质金属蛋白酶9（matrixmetall oproteinases，MMPs）属于Zn2+依赖性蛋白水解酶家族，能够水解基底膜（BM）和细胞外基质（ECM），从而促进肿瘤细胞的浸润转移，且国外报道证实结肠直肠癌患者MMP-9表达水平高者预后明显低于表达水平低者［9-11］。据报道［12］：Kiss-1通过抑制NF-κBp65与基质金属蛋白酶MMP-9启动子结合而减少MMP9合成，故Kiss-1基因对MMP-9表达呈负调控。本研究结果与既往研究类似：在结直肠癌组织中，MMP-9表达明显高于正常黏膜组（P＜0.05）。

综上所述，本研究表明了Kiss-1基因在浸润深、有淋巴结或远处转移的结直肠癌组织中表达减低，作为转移抑制基因其表达减低提示其转移趋势及预后较差。同时其与MMP-9表达呈负调控关系（r=-0.407，P＜0.05）。Kiss-1、MMP-9在结直肠癌的淋巴结转移中具有重要作用，可做为大肠癌转移的预测因子及大肠癌的治疗靶点，对于结直肠癌的防治具有重要的临床意义。

1林素勇，戴起宝，陈绍勤，等.Kissl蛋白及其受体GPR54在结直肠癌中表达的意义.肿瘤研究与临床，2010，22（6）：406-409.

2Maitra A，Ashfaq R，Gunn CR，et al.Cyclooxygenase 2 expression in pancreatic adenocarcinoma and pancreatic intraepithelial neoplasia：an immunohistochemical analysis with automated cellular imaging.Am J Clin Pathol，2002，118（2）：194-201.

3Lee JH，Miele ME，Hicks DJ，et al.KiSS-1 anovel human malignant melanoma metastasis suppressor gene.J Natl Cancer Inst，1996，88（23）：1731-1737.

4Goldberg SF，Miele ME，Hatta N，et al.Melanoma metastasis suppression by chromosome 6：evidence for a pathway regulated by CRSP3 and TXNIP.Cancer Res，2003，63（2）：432-440.

5Lee JH，Welch DR.Identification of highly expressed genes in metastasis-suppressed chromosome 6/human malignant melanoma hybrid cells using subtractive hybridization and differential display. IntJ Cancer，1997，71（6）：1035-1044.

6Weldon CB，Burou ME，Rolfe KW，et al.NF-κB mediated chemoresistance in breast cancer cells.Surgery，2001，130（2）：143-150.

7Wang CY1，Cusack JC Jr，Liu R，et al.Control of inducible chemoresistance：enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-κB.Nat Med，1999，5（4）：412-417.

8何进，秦新裕.人胃癌组织Kiss-1基因表达水平的检测.实用癌症杂志，1999，14（2）：101-102.

9Ramos-Desimone N，Hahn-Dantona E，Sipley J，et al.Activation of matelloproteinase-9（MMP-9）viaaconvergingplasmin/ stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion.J Biol Chem，1999，27（19）：13066-13076.

10 Ambiru S，Miyazaki M，Ito H，et al.A prospective study of prognostic value of type IV collagenase activity in colorectal cancer tissue. Dig Dis Sci，1997，42（8）：1660-1665.

11 Zeng ZS，Huang Y，Cohen AM，et al.Prediction of colorectal cancer relapse and survival via tissue RNA levels of matrix metalloproteinase-9.J Clin Oncol，1996，14（12）：3233-3140.

12 Sanchez-Carbayo M1，Capodieci P，Cordon-Cardo C.Tumor suppressor role of KiSS-1 in bladder cancer：loss of KiSS-1 expression is associated with bladder cancer progression and clinical outcome. Am J Pathol，2003，162（2）：609-617.

2015-03-04）

（本文编辑：陈烨）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.016

1 637000川北医学院附属医院消化内科；2 637007川北医学院校医院

王显飞，E-mail：meishanyy@163.com

四川省教育厅科研项目（14ZB0201））