139株结核分枝杆菌耐药性分析及耐药基因检测

黄可儿　王琴　管鸽　陈卓美

139株结核分枝杆菌耐药性分析及耐药基因检测

黄可儿王琴管鸽陈卓美

目的 了解本地区结核分支杆菌菌株的耐药状况，建立适合本地区结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法 2013年5月至9月143例患者的痰液标本中获得的结核分支杆菌，分离培养获得试验菌株139株，进行菌株鉴定和药物敏感实验，并从中随机抽取12株菌株，利用试剂盒MTBDR-plus（德国HAⅠN Lifescience）进行rpoB、katG及inhA基因检测。结果 139株结核分枝杆菌复合群菌株中，对4种一线抗结核药物的总体耐药率为19.58%，其中17株（12.23%）至少对ⅠNH耐药，12株（8.63%）至少对RFP耐药，15株（10.79%）至少对SM耐药，3株（2.16%）至少对EMB耐药。在随机抽取的12株菌株中，耐药基因检测结果与药物敏感试验作比较，结果显示两组数据结果大致相符。结论 耐多药结核菌株增多，应迅速建立准确快速的药物敏感性检测方法。试剂盒MTBDR-plus值得推广。

结核分枝杆菌 耐多药 耐药基因 HAⅠN

结核病（TB）是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患的严重传染病，结核病的病死率在全球范围内均有上升的趋势［1］。异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）作为一线抗痨药，其耐药性的出现，对感染耐药性结核杆菌患者的治疗带来较大困难。进行TB耐药和耐多药的分析研究，对控制耐药和耐多药结核病有重要意义［2］。结核分枝杆菌耐异烟肼的产生是与过氧化氢酶—过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，和inhA基因突变也有相关性；结核分支杆菌耐利福平与其核心区域rpoB基因突变有关［3，4］。本实验采用药物敏感试验，观察本地区的结核耐药情况，同时利用试剂盒MTBDR-plus［5］进行rpoB、katG及inhA基因检测，比较两种方法，从而为临床治疗提供可靠依据。

1　临床资料

1.1一般资料 2013年5月至9月从本院143例结核病患者的痰标本中获得的结核杆菌做分枝杆菌分离培养检测，其中男93例，女50例；年龄13～86岁，中位年龄48岁。对143株进行菌型初步鉴定，其中139株（97.2%）属于结核分枝杆菌复合群， 4株（2.8%）属于非结核分枝杆菌，未作进一步的具体菌种分类鉴定。

1.2试剂与仪器 酸性改良罗氏（L-J）培养基及含药培养基（上海市肺科医院配制），MTBDR plus试剂盒（德国Hain Lifescience）；GT-Blot 20全自动杂交仪（德国Hain Lifescience）、PCR仪（德国Biometra公司）。结核分枝杆菌标准菌株H37Rv由上海市肺科医院提供。

1.3方法 （1）痰标本去污染处理：对照患者姓名挑取约5ml标本至50ml已标记的密封带螺旋帽离心管中，加等量2%NALC-NaOH标本前处理液，旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋振荡10～20s，直至痰充分液化，静置15min。再加入无菌PBS（pH6.8）至40ml，盖紧盖子，上下混匀。放入带内密封的离心机（L550低速离心机）内，3000g离心15min，吸掉上清液。添加1ml PBS（pH6.8）以中和PH，约1～2 min，混匀备用。（2）分离培养：分别将抗酸染色阳性的痰标本，每份标本同时接种2只L-J培养基。取接种后的改良罗氏培养基置恒温培养箱（GRP-9270型隔水式恒温培养箱），（36±1）℃斜面水平孵育。待24h后，将培养基直立放置，（36±1）℃下继续孵育。观察2次/周，有菌落生长者，抗酸染色确认后报告“分枝杆菌培养阳性”。（3）药物敏感试验：本实验采用绝对浓度法［6，7］，每种药物测试低、高两种浓度。4种一线抗结核药物的培养基内最终浓度分别为：INH：1μg/ml，10μg/ml；RFP：50μg/ml，250μg/ml；SM：10μg/ml，100μg/ ml；EMB：5μg/ml，50μg/ml。首先制备1 g/L菌悬液，稀释至10mg/L，用微量吸管接种0.1ml至对照及含药培养基上，37℃培养4周后报告结果。低浓度含药培养基未生长分枝杆菌报告敏感（S），有生长报告耐药（R）。耐药的判定标准：对照培养基菌落生长良好，含药培养基上菌落＞20个为耐药，含药培养基上无菌落生长为敏感，菌落介于l～20个时重新检测。在本资料中，当低浓度耐药时，认为测试菌株对该药物具有耐药性。（4）试剂盒MTBDR-plus（德国HAIN Lifescience）方法：①DNA提取：用接种环收集固体培养基上生长的细菌，浸入约300μl去离子水使之悬浮，95℃水浴孵育20min，超声波水浴15min，缓慢减速5min，取上清5μl进行PCR。②复合扩增：反应体系包含35μl引物核苷酸混合物，5μl 10×扩增缓冲液，2μl 25 mmM MgCl2 缓冲液，1 U热启动Taq聚合酶以及5μl DNA模板，总反应容积为50μl，整个过程严格按照操作手册进行。③杂交显色：根据MTBDR plus试剂盒的操作说明，生物素标记的PCR产物进行化学变性后与特异性的寡核苷酸探针进行杂交，再通过碱性磷酸酶促反应显色。④探针排列与检测方案：探针采用以下3种方案对DNA条带进行控制。第1种探针：与23S rRNA 基因（tub）的结核分支杆菌特异区段互补，故会使所有结核分支杆菌株显示阳性。若TUB区域阴性，检测的细菌就不属于结核分枝杆菌。第2种探针：作为内对照，由于同源性结合与底物着色正确进行时发生线形延伸，若扩增正确进行则显示阳性。第3种探针（3类）：3类探针分别特异性与rpoB，katG 和inhA基因互补，进行位点控制，当TUB提示是结核分支杆菌时会显示为阳性：8个rpoB野生型探针包含了编码505至534.4位氨基酸的rpoB 基因区段，其他探针特异性识别大部分常见突变：D516V、H526Y、H526D和S531L。

1.3统计学分析 患者的基本资料来源于本院实验室信息管理系统（LIS），标本的实验室检测数据来自试验记录，数据整理使用Microsoft Excel。

2　结果

2.1药物敏感试验结果 见表1。

表1　139株结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物的耐药情况

2.2139株结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物的耐药情况 见表2。

表2　139株结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物的耐药情况

2.3试剂盒MTBDR-plus：随即抽取12株菌株，具体数据 见表3。

表3　随机抽取12株菌株两种方法结果数据

3　讨论

目前治疗TB主要使用化学药物，然而由于抗结核药物的不规范治疗，病人体内的结核菌对多种抗结核药物发生耐药，从而形成耐多药结核病（MDR-TB），这是TB疫情重新上升的最主要的原因之一。近年来我国TB耐药状况的研究越来越多，不同地区之间存在着一定的差异。本市主要耐药类型为异烟肼、利福平和链霉素为主，患者中男性比例明显高于女性。单耐药、多耐药和耐多药结核菌株比例相当，和以往数据相比，多耐药以及耐多药比例升高，数量增加，因此监测患者的耐药性更显得重要。

结核分枝杆菌培养周期长，耐药结核分枝杆菌生长更为缓慢，目前，尚无方法能直接鉴定分枝杆菌临床标本。国内多采用药物敏感试验和基因方法对菌株做耐药性检测，而基因方法使用较多。常规的基因检测方法因其简便、快速，已被大家广泛研究和应用，但是，随着耐药基因的不断出现，需检测的基因数量越来越多，尤其是多耐药结核杆菌的出现，使得检测显得较为繁琐。由于条件所限本资料仅对12株结核分枝杆菌的rpoB、katG及inhA基因进行了检测，检测结果与药物敏感试验结果有较好的重复性，1号患者菌株野生型rpoB基因探针检出ΔWT7；MUT1突变，药敏试验利福平为敏感，考虑其原因可能是由于该突变并非利福平耐药特异突变位点，也有可能由于药敏结果不准确所致［8］。

1 汪保国，陈思东，周卫平，等.结核杆菌对异烟肼药物的敏感性试验.中国实用医药杂志，2008，12（3）：36.

2 中国防痨协会.耐药结核病化学治疗指南（2009）.中华结核与呼吸杂志，2010，33（7）：485～497.

3 WilliamsD，Waguespack C. Characterization of rifampin in pathogenic mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother，1994，38（2）：2380.

4 Uys PW， Warren R. Potential of rapid diagnosis for controlling drug susceptible and drugresistant tuberculosis in communities where Mycobacterium tuberculosis infections are highly prevalent. J Clin Microbial， 2009， 47（5）：1484.

5 Patel JB，Leonard DG，Pan X，et al. Sequence-based identification of mycobacterium species using the Microseq 500 16S rDNA bacterial identification system. J Clin Microbial，2000，38（1）：246～251.

6 中华医学会.临床技术操作规范·结核病分册.北京：人民军医出版社，2004.

7 World Health Organization.Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis. Geneva，Switzerland：WHO，2006.

8 刘敬华，张丽水，刘志广，等.结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征初步分析.中华流行病学杂志，2006，27（11）：973～976.

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