X射线全身照射对小鼠胸腺重量 细胞数及细胞凋亡的影响

徐瑞明　张占春　金顺子★

X射线全身照射对小鼠胸腺重量 细胞数及细胞凋亡的影响

徐瑞明张占春金顺子★

目的 探讨X射线躯体辐射对小鼠胸腺重量、细胞计数及细胞凋亡的影响。方法 2.0Gy与0.075Gy X射线照射后0、2、4、8、16、24及48h，采用直接称重、显微镜下计数、流式细胞术分别检测小鼠胸腺的重量、细胞数及细胞凋亡情况。结果 2.0Gy X射线照射后小鼠胸腺重量先升高后下降，而胸腺细胞数显著下降，到48h两者均降至最低水平；而胸腺细胞凋亡显著增加，48h达到最高水平。0.075Gy照射后胸腺重量及胸腺细胞数显著升高而胸腺细胞凋亡没有明显变化。结论 高剂量辐射（HDR）作用下胸腺的重量、细胞计数下降，而胸腺细胞凋亡增加，对免疫系统有明显的抑制作用。低剂量辐射（LDR）可以在一定程度上促进胸腺的重量增加、细胞数目增多，细胞凋亡减少，有免疫兴奋作用。

电离辐射 胸腺 细胞凋亡

免疫系统对肿瘤的监视与机体的先天性和获得性免疫功能有关，单核巨噬细胞系统、T 淋巴细胞和NK细胞以及相关的细胞因子和抗体等均参与机体对肿瘤的免疫监视作用。胸腺作为中枢免疫器官，是淋巴样干细胞（LSC）分化为成熟T细胞的唯一场所。来源于胸腺的淋巴细胞对辐射十分敏感，因此胸腺在辐射免疫中占有重要地位。中等剂量以上的电离辐射降低免疫功能，亦是辐射致癌发生的基础之一。低剂量辐射（LDR）可以增强免疫功能，是辐射兴奋效应的重要组成部分，在放射生物学和放射医学领域中备受关注［1］。T淋巴细胞数量的变化是高剂量辐射（HDR）抑制免疫反应和LDR增强免疫反应的关键因素之一［2］。作者自2010年4月至6月观察了2.0Gy及0.075Gy X射线作用下小鼠胸腺的重量、细胞计数及细胞凋亡的变化，从相对宏观角度探讨电离辐射对免疫系统的影响。报道如下。

1　材料和方法

1.1实验动物 雄性健康昆明系普通级小鼠共60只，体重18～22g，由吉林大学白求恩医学部实验动物部提供。1.2 照射条件 国产X.S.S.205（FZ）型固定式 X射线深部治疗机，电压180kV，电流15mA，滤板0.5mmCu+1.0mmAl。单次LDR（0.05～0.2Gy），靶皮距280cm，吸收剂量率12.5mGy/min。＞0.5Gy剂量照射时，靶皮距66.5cm，吸收剂量率0.287Gy/min。

1.3方法 采用简单随机法将动物分为HDR组30只和LDR组30只，分别予2Gy、0.075Gy X射线躯体照射0、2、4、8、16、24 及48h，各组小鼠照射后断头处死，迅速取出胸腺，电子天平称重，记录实验结果。然后分别置于PBS中，用毛玻璃片挤压，制成细胞悬液后用200目尼龙网过虑，去除结缔组织，1500 rpm离心1min弃上清液，PBS洗涤2次。胸腺细胞一部分制成单细胞悬液，涂片，通过荧光显微镜进行计数分析；另一部分应用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4细胞凋亡检测 采用美国B-D公司生产的FACScan流式细胞仪，激发光源为15mW氟离子激光，波长488nm。应用直接荧光法检测，FACS软件收集细胞，CellQuest软件分析处理数据，记录凋亡细胞百分率。1.5 统计学处理 分别用Excel和SPSS15.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较使用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1X射线照射后小鼠胸腺重量的变化 见表1。

表1　不同剂量X射线照射后小鼠胸腺重量的变化［mg（±s）］

表1　不同剂量X射线照射后小鼠胸腺重量的变化［mg（±s）］

注：与0h比较，*P＜0.05，**P＜0.01

135.40±18.28135.40±18.28 2 158.80±10.96*170.20±19.60* 4 141.00±26.32156.60±18.09 8 131.80±19.11167.60±22.40* 1698.00±14.09**159.20±20.95 2466.60± 2.88**158.20±27.69 4843.60±4.34**146.40±11.19时间 （h）HDR组LDR组0

2.2X射线照射后小鼠胸腺细胞计数的变化 见表2。

表2　不同剂量X射线照射后小鼠胸腺细胞计数的变化［×107（±s）］

表2　不同剂量X射线照射后小鼠胸腺细胞计数的变化［×107（±s）］

注：与0h比较，*P＜0.05，* *P＜0.01

28.44±11.5128.44±11.51 2 20.05±3.5130.80±5.77 4 23.60±8.7033.84±5.45 8 14.65±3.81*32.95±9.30 1610.84±2.31*21.50±4.86 246.40±1.56**33.00±2.70 484.40±1.04**44.58±3.44*时间（h）HDR组LDR组0

2.3X射线全身照射后小鼠胸腺细胞凋亡率的变化 见表3。

表3　不同剂量X射线照射后小鼠胸腺细胞凋亡率的变化［%（>±s）］

表3　不同剂量X射线照射后小鼠胸腺细胞凋亡率的变化［%（>±s）］

注：与0h比较，*P＜0.05，* *P＜0.01

0.058±0.020 0.058±0.020 2 0.040±0.017 0.038±0.014 4 0.114±0.0420.054±0.020 8 0.138±0.036 0.068±0.014 16 0.126±0.021* 0.020±0.004 24 0.220±0.056* 0.094±0.016 48 0.310±0.037** 0.106±0.028时间 （h）HDR组LDR组0

3　讨论

LDR与较大剂量躯体照射所引起的小鼠胸腺细胞周期进程的变化截然不同，LDR引起明显的刺激效应；而HDR导致显著的抑制效应［3］。2.0Gy照射后胸腺重量先升高后下降，而细胞计数无升高，并从8 h开始呈时间依赖性显著下降。HDR作用下胸腺重量在2h时显著升高，而此时细胞计数却没有显著变化，这种现象可能与早期胸腺充血水肿及一些细胞因子的分泌有关，而并不直接影响胸腺细胞增殖或凋亡。这种机制也解释了临床上2.0Gy放疗后患者早期肿瘤病灶并不明显缩小甚至增大的原因。有文献报道在辐射损伤发生的早期，胸腺组织VEGF mRNA表达水平显著增高，在促进血管内皮细胞增殖、抗凋亡以及促使受辐射组织血管新生中起到重要作用［4］。胸腺重量和细胞计数均呈时间依赖性下降，从组织水平上进一步证明HDR具有时间依赖性的损伤效应，为辐射损伤及肿瘤治疗奠定了一定的理论基础。

本实验结果提示0.075Gy照射后胸腺重量及细胞计数显著高于照射前，表明LDR可以促进胸腺细胞的增殖，使胸腺重量增加，从组织水平证明了LDR具有一定的免疫兴奋效应。有文献［5］报道，0.075Gy照射后IL-12、IFN-γ的分泌量在照射后12h内变化不明显，而后IL-12于24、72 h，IFN-γ于48 h均出现显著升高，这可能与树突状细胞、T淋巴细胞的活化有关。TGF-β1含量在照射后不同时间均较对照组明显降低。这些细胞因子的时程变化与本实验中细胞计数的变化基本一致，进一步解释了本资料中胸腺在细胞、组织水平上的变化。

胸腺重量显著增加发生在细胞计数增加的40多个小时前，其原因可能是在LDR兴奋作用下导致血液循环增加、激发炎症反应、细胞因子分泌增多等导致胸腺重量的增加，从而为以后促进细胞分裂或抑制细胞凋亡作好了充分的物质准备。LDR改变了免疫细胞外环境，促使胸腺细胞成熟、分化和增殖加速，凋亡减少［6］。0.075Gy X射线使胸腺CD4-CD8-细胞比例增高而其他亚组的细胞比例无改变，而且CD3+细胞数比例增高，说明0.075Gy X射线一方面促使胸腺细胞更新，另一方面加速胸腺细胞的成熟分化［7］。这种免疫兴奋效应增强了机体免疫力，有助于缓解患者及家属对于LDR有关的临床检查的担忧与恐惧。

本实验表明2.0Gy照射后胸腺细胞凋亡逐渐升高，48 h时达到最高水平。2.0Gy照射后胸腺重量、细胞计数的变化基本一致，而细胞凋亡的变化却与之相反，这说明了3者之间存在着密切的关系：在HDR作用下，细胞凋亡的增多导致了细胞数减少，最终导致胸腺重量下降。有实验［8］证明LDR 0.05Gy和0.075Gy全身照射后，胸腺细胞的凋亡明显低于对照组，剂量超过0.20Gy时，细胞凋亡开始增加，2.0Gy和4.0Gy组细胞凋亡显著高于对照组。6Gy60Coγ射线照射胸腺后1～6d，促凋亡基因和抑制凋亡基因处于一个动态的变化之中，当促凋亡基因占优势时，细胞即开始发生凋亡，细胞增殖受到抑制，这很可能是照射后早期（3～24 h）凋亡率持续升高、损伤不断加重的重要原因之一［9］。LDR使CD4+细胞的辅助功能和CD8+细胞抑制功能增高，而且流式细胞术检测细胞凋亡不但未增多甚至出现减少。本资料中0.075Gy照射后胸腺细胞凋亡也受到抑制，但差异无统计学意义，其原因可能是细胞凋亡的显著性改变多发生在48h之后。有实验数据［10］表明，将小鼠进行0.075Gy X射线躯体照射24h，其脾细胞经Con A刺激48 h，细胞外液使2Gy X射线全身照射后体外培养的小鼠胸腺细胞凋亡降低，尤其在培养后72 h 降低明显。

综上所述，在2.0Gy X射线作用下胸腺的重量、细胞计数呈时间依赖性逐渐下降，而胸腺细胞凋亡呈时间依赖性增加，说明HDR对免疫系统有明显的抑制作用。0.075Gy X 射线照射可在一定程度上促进胸腺的重量增加、细胞数目增多，说明LDR有某种免疫兴奋作用，其中更深层次的机制有待进一步研究。

1 刘树铮.低剂量辐射兴奋效应发生机理若干问题的探讨.中华放射医学与防护杂志，2003，23 （6）：393～398.

2 Liu S Z， Qi J， Zhang Y C. et al.Thymocyte apoptosis in response to low-dose radiation.Mutat Res，1996，358（2）：185～191.

3 叶飞，刘树铮.不同剂量X射线全身照射对小鼠胸腺细胞周期进程的影响.辐射防护，2000，20（3）：189～192.

4 王洪艳，齐亚莉，龚守良，等.BMSCs移植对辐射诱发小鼠胸腺瘤VEGF mRNA水平的影响.Modern Preventive Medicine，2012， 39（12）：3085～3087.

5 董娟聪，林承赫，金顺子，等.低剂量x射线对小鼠树突状细胞与T淋巴细胞之间免疫反应的影响.Chin J Radiol Med Prot，2012， 32（1）：P55～57.

6 吕喆，刘淑春，孙祖玥，等.低剂量电离辐射诱导小鼠胸腺细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的时间效应.中华放射医学与防护杂志，2001，21（4）：276～278.

7 苏旭，张迎春，刘树铮.X射线全身照射对胸腺CD3+细胞的影响.白求恩医科大学学报，1995，21（1）：36～38.

8 牟颖，刘树铮.X射线对小鼠胸腺细胞凋亡的影响.中华放射医学与防护杂志，1996，16（5）：296～298.

9 崔玉芳，姜竺君，杜丽，等.γ线照射小鼠胸腺组织基因表达转录谱分析. Chin J Radiol Med Prot，2009，29（4）：P355～359.

10 龚守良，刘建香，刘淑春，等.小剂量照射的脾细胞外液对较大剂量照射小鼠胸腺细胞凋亡的影响.辐射研究与辐射工艺学报，1997，1（5）：36～39.

Objective To study the effect of mouse WBⅠ（whole body irradiation，WBⅠ）with X-rays on weight，cell number and apoptosis of the thymus. Methods Weighing，microscope count and fl ow cytometry were respectively used to detect the changes in weight，cell number and apoptosis of the mouse thymus at different times（0，2，4，8，16，24 and 48 h） after WBⅠ with X-rays of 0.075 and 2.0Gy. Results The weight of thymus in mice fi rstly increased and then decreased； cell counts decreased gradually in a time-dependent manner；both reached their nadir at 48h；while the apoptosis of thymocytes increased in a time-dependent manner and peaked at 48h after WBⅠ with X-rays 2.0Gy. The weight and cell number of thymus were promoted signifi cantly and apoptosis did not change signifi cantly after WBⅠ with X-rays 0.075Gy. Conclusion HDR could reduce the quality of thymus，decrease cell accounts and enhance apoptosis. LDR could improve the quality of thymus，increase cell accounts and inhibit apoptosis to some extent. HDR could signifi cantly inhibit immune system while LDR could stimulate immune system.

X-irradiation Thymus Apoptosis

国家自然科学基金资助项目（30100033）

315041 浙江省宁波市医疗中心李惠利医院放疗科（徐瑞明 张占春）

130021吉林大学公共卫生学院放射生物教研室（金顺子）