柳氮磺胺吡啶及美沙拉嗪对溃疡性结肠炎结肠黏膜Reg ⅠV蛋白表达的影响及意义

朱春霞　秦丽君★

柳氮磺胺吡啶及美沙拉嗪对溃疡性结肠炎结肠黏膜Reg ⅠV蛋白表达的影响及意义

朱春霞秦丽君★

目的 探讨柳氮磺吡啶（SASP）及美沙拉嗪对溃疡性结肠炎结肠黏膜Reg ⅠV蛋白表达的影响及意义。方法 收集溃疡性结肠炎患者60例，分成SASP组（A组）和美沙拉嗪组（B组），随访及治疗8周后复查肠镜及黏膜活检，通过RT-PCR、免疫组化检测Reg Ⅳ表达水平。结果 RT-PCR、免疫组化结果提示Reg Ⅳ在两组治疗前表达差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后两组表达均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；美沙拉嗪组下降水平＞SASP组（P＜0.05）；Reg ⅠV表达水平与溃疡性结肠炎活动度呈正相关（r=0.872，P＜0.001）。结论 美沙拉嗪较柳氮磺胺吡啶对Reg Ⅳ有更强的抑制作用。

溃疡性结肠炎 Reg Ⅳ 柳氮磺胺吡啶 美沙拉嗪

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病因尚不清楚的直肠和结肠慢性非特异炎症性疾病，癌变是其严重的并发症之一。国外有报道起病20年和30年后癌变率分别为7.2%和16.5%，虽然溃疡性结肠炎相关癌（UC-CRC）只占所有结肠癌的1%～2%，但是却占UC患者死亡原因的10%～15%［1］。再生基因IV（Reg Ⅳ）是钙依赖的植物血凝素超家族成员之一，于2001首次从炎症性肠病患者中被分离［2］，是消化系统肿瘤发生的早期标志物。作者通过检测UC患者分别应用SASP及美沙拉嗪治疗前后结肠黏膜中Reg IV蛋白表达水平，分析其表达水平变化的情况，探讨两者对结肠黏膜中Reg IV蛋白的表达方面是否存在差异。报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 选取2011年1月至2014年1月在本院消化内科门诊和住院患者60例，征求受检者同意后，经结肠镜及组织病理学检查确诊，并同意随访及8周后复查肠镜及病理学检查；均选择轻、中型UC患者，初发型、慢性复发型及慢性持续型均可，需处活动期，即疾病活动指数（DAI）≥3（采用改良型Mayo评分评价溃疡性结肠炎活动指数）。随机分为A组和B组，二组年龄、性别、病程等一般情况差异无统计学意义，具有可比性。排除标准：（1）有严重心、肝、肾等重要脏器和血液、内分泌系统疾病者。（2）有活动性胃、十二指肠溃疡者。（3）消化道肿瘤者。（4）有肠道切除手术者。（5）孕妇、哺乳期妇女。（6）有水杨酸制剂及磺胺类药物过敏或过敏体质者。（7）精神病患者。所有患者必须停用一切影响UC的药物≥1周（包括激素、SASP、中药等）。

1.2方法 （1）药物治疗：A组：予SASP肠溶片（山西三九同达公司）1.0，口服，4次/d，疗程8周。B组：予美沙拉嗪肠溶片（爱的发制药公司）1.0口服，4次/d，疗程8周。（2）荧光定量PCT（RT-PCR）：将肠黏膜组织标本用液氮研磨成粉末后，加1ml TRIZOL（BBI）抽提Total RNA，采用NanoDrop® ND-2000测定RNA浓度和纯度，根据RNA浓度结果将各组调成一致的浓度，再应用RT试剂（Takara）将RNA逆转录成cDNA。定量PCR引物如下：GAPDH正义链：5'-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'，反义链：5'-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3'；Reg IV正义链：5'-CTGCTCCTATTGCTGAGCTG-3'，反义链：5'-GGACTTGTGGTAAAACCATCCAG-3'。定量PCR反应条件：95℃预热2min，95℃解链10s，扩增：40循环95℃/10s，60℃/34 s，72 ℃/15 s；扩增反应结束后，按95℃/10s；60℃/60s；95℃/15s的反应条件建立PCR产物熔解曲线；数据采用2-△△CT法进行分析。（3）免疫组化：两组均进行免疫组化SABC染色。一抗工作浓度为1 ∶ 50～1 ∶ 100。抗原热修复，UEF显色，苏木精复染。所有切片均进行HE常规染色。以上步骤均按说明书操作，严格控制时间及温度，每次染色设阳性对照，PBS 替代一抗作为阴性对照。由两名病理科医师采用盲法独立判定免疫组化染色的结果。随机选取5个高倍视野，计数1000个细胞，根据阳性细胞所占比例分为Ⅳ级：阴性（-）：阳性细胞数0%～5%、弱阳性（+）：阳性细胞数6%～25%、阳性（++）：阳性细胞数26%～75%、强阳性（+++）：阳性细胞数＞76%。阳性表达率以（++）和（+++）之和占总例数的百分比表示。

1.3统计学方法 采用SPSS16.0软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析，计数资料采用χ2检验，Reg IV与溃疡性结肠炎活动度相关性采用Pearson 相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SASP及美沙拉嗪治疗前后Reg Ⅳ的表达情况 治疗前，患者肠黏膜Reg ⅣmRNA表达无明显差异（P＜0.05）；治疗后患者肠黏膜Reg Ⅳ表达均低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），两组均较治疗前明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后美沙拉嗪组Reg IV水平下降＞SASP组（P＜0.05）。SASP治疗后Reg Ⅳ的表达情况：0（11 例，36.7%），1+（11例，36.7%），2+（8例，26.7%），3+（0例）；而美沙拉嗪治疗后Reg IV的表达情况：0（17 例，56.7%），1+（9例，30%），2+（4例，13.3%），3+（0例）。见图1、2。

图1　SASP及美沙拉嗪治疗前后Reg Ⅳ mRNA的表达情况

图2　Reg Ⅳ在UC患者中的表达情况

2.2Reg IV与UC活动度之间的关系 Reg Ⅳ在两组治疗前后的变化与CAI指数在两组治疗前后的变化呈正相关（P＜0.01）。治疗前，Reg Ⅳ不同染色强度中 CAI 分别为1+（3.75±0.96）、2+（7.16±1.33）和3+（10.63±1.12）；治疗后，Reg Ⅳ不同染色强度中CAI 分别为 0+（3.29±1.33）、1+（7.06±1.56）和 2+（8.93±0.92）；强表达Reg Ⅳ的患者CAI 指数较弱表达 Reg Ⅳ患者的明显升高（P＜0.05）。

3　讨论

Reg IV是再生基因家族中的一员，作为一种新发现的基因，其生物学功能尚无明确定论。Reg Ⅳ主要位于胃肠道，包括结肠、小肠、胃和胰腺［3，4］。RegⅣ蛋白是选择性表达于胰腺和胃肠道上皮的小分子分泌性蛋白，参与消化系统上皮细胞的增殖、再生和炎性、化生反应，并与消化系统肿瘤的发生、发展密切相关。赖明广等［5］认为Reg IV可作为预测UC活动度的一个独立指标。在结肠、胆囊及胃等肿瘤组织中均可发现Reg IV蛋白表达水平增高［3，4，6～9］，目前UC已被公认为是大肠癌的危险因素之一，近10年来我国UC的发患者数增加了3倍，预示UC-CRC的风险增加，UC患者患结肠癌的风险每年增加约0.5%～1.0%［10］。因此，指导临床如何选择合理有效的治疗及预防UC-CRC的发生，从而改善预后、提高UC患者生存质量显得十分重要。结肠黏膜Reg IV蛋白的检测已经成为人们探索UC早期发生癌变等病理过程的新手段。根据本资料结果，作者认为美沙拉嗪较SASP能更有效的抑制Reg IV的表达，因此美沙拉嗪较SASP具有更好的化学预防作用，但本次试验标本量小，有待于进一步探讨。

1 Andersen N N，Jess T.Has the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease decreased？.World J Gastroenterol，2013，19（43）：7561～7568.

2 Hartupee J C，Zhang H，Bonaldo M F，et al.Isolation and characterization of a cDNA encoding a novel member of the human regenerating protein family：Reg IV.Biochim Biophys Acta，2001，1518（3）：287～293.

3 Kuniyasu H，Oue N，Sasahira T，et al.Reg IV enhances peritoneal metastasis in gastric carcinomas.Cell Prolif，2009，42（1）：110～121.

4 Violette S，Festor E，Pandrea-Vasile I，et al.Reg IV， a new member of the regenerating gene family，is overexpressed in colorectal carcinomas.Int J Cancer，2003，103（2）：185～193.

5 赖明广，张亚历.RegⅣ在溃疡性结肠炎中的表达及其对疾病活动度的预测价值.现代消化及介入诊疗，2010，15（2）：71～73.

6 Tamura H， Ohtsuka M， Washiro M， et al. Reg IV expression and clinicopathologic features of gallbladder carcinoma.Hum Pathol，2009，40（12）： 1686～1692.

7 Gu Z， Rubin M A， Yang Y， et al.Reg IV：a promising marker of hormone refractory metastatic prostate cancer.Clin Cancer Res，2005，11（6）： 2237～2243.

8 Zhao J， Wang J， Wang H， et al.Reg proteins and their roles in inflammation and cancer of the human digestive system.Adv Clin Chem，2013， 61：153～173.

9 Zheng HC，Xu X Y，Yu M，et al.The role of Reg IV gene and its encoding product in gastric carcinogenesis.Hum Pathol，2010，41（1）：59～69.

10 Jess T，Rungoe C，Peyrin-Biroulet L.Risk of colorectal cancer in patients with ulcerative colitis： a meta-analysis of population-based cohort studies.Clin Gastroenterol Hepatol，2012，10（6）：639～645.

Objective To explore the effects of sulfasalzine and mesalazine on the expression of Reg ⅠV in mucosa with ulcerative colitis and its signifi cance. Methods Sixty patients with ulcerative colitis were included in the study，they were randomized in Sulfasalzine and Mesalazine therapy groups，8 weeks after two kinds of therapy，they were undergone colonoscopy examination and mucosa biopsy， Reg ⅠV expression was investigated by RT-PCR and Ⅰmmunohistochemical staining. Results RT-PCR and immunohistochemistrical staining for Reg Ⅳ after the therapy in the mucosa was signifi cantly lower than that before the therapy in ulcerative colitis （P＜0.05）. Mesalazine therapy group signifi cantly decreased Reg ⅠV level than Sulfasalzine therapy group. There was a positive correlation between Reg ⅠV and CAⅠ （the colitis activity index） expression in UC（r = 0.872，P＜0.001）. Conclusion Mesalazine signifi cantly inhibits Reg ⅠV levels than Sulfasalzine.

Ulcerative colitis Reg ⅠV Sulfasalzine Mesalazine

315020 浙江省宁波大学医学院附属医院