Box-Behnken设计-效应面法优化微波辅助提取废次烟叶中烟碱的工艺研究

黄 飞， 张 哲， 魏先文， 陈国平， 杨富功， 杨可可

（1.黄山学院化学化工学院，安徽　黄山　245041；2.安徽工业大学化学与化工学院，安徽　马鞍山　243002）

Box-Behnken设计-效应面法优化微波辅助提取废次烟叶中烟碱的工艺研究

黄 飞1， 张 哲1， 魏先文2， 陈国平1， 杨富功1， 杨可可1

（1.黄山学院化学化工学院，安徽黄山245041；2.安徽工业大学化学与化工学院，安徽马鞍山243002）

目的 Box-Behnken设计-效应面法优化微波辅助提取烟叶中烟碱工艺。方法 以烟碱的提取率为评价指标，考察浸泡时间、固液比、微波功率、微波辐射时间4个因素对烟碱提取率的影响，采用Box-Behnken设计-效应面法优化微波辅助提取工艺，并进行预测分析。结果 浸泡时间、微波辐射时间、固液比、微波功率对烟碱的提取率具极显著影响，确定微波辅助提取烟碱的最优提取工艺为：浸泡时间为6 h，微波辐射时间7 min，固液比为0.1，微波功率为800W。结论 Box-Behnken设计-效应面法优化微波辅助提取烟叶中烟碱工艺，建立的数学模型和实验观察数据相符，该提取工艺合理，精确度高，可预测性好。

Box-Behnken设计-效应面法；微波辅助；废次烟叶；烟碱；提取

烟碱又称尼古丁（nicotine，Nic），是烟草的主要成分之一。一般人们认为烟碱是烟叶中的主要毒性物质，其实这是一种误解。流行病学研究报告表明，烟碱可以有效清除活性氧自由基，能够抑制多巴胺自氧化，可以降低老年痴呆症和帕金森氏综合症的发病率［1-2］，能治疗精神分裂症、抑郁症等，对妇女子宫内膜异位症、子宫肌瘤、子宫内膜癌、乳腺癌等雌激素依赖性疾病有较好的疗效［3］。烟碱还可以用于戒烟，提高戒烟的成功率，避免吸烟产生的有害物质对身体的毒害［4-5］。

目前从烟叶中提取烟碱的常见方法有水蒸气蒸馏法［6］、连续逆流提取法［7］、溶剂萃取法［8］、超临界萃取法［9］、离子交换法［10］、超声辅助酶法［11］等。以上方法设备成本、技术要求较高，萃取过程中可能有新的组分产生等缺点。微波辅助提取可以显著加速传质过程，提高提取效率，容易实现工业化应用［12］。与传统的提取方式相比较，具有明显的优势。微波辅助提取大多是采用正交设计实验对烟碱提取工艺进行考察［11，13-14］，考虑正交设计的局限性，本研究以废次烟草为原料，通过Box-Behnken设计-效应面法优化微波辅助提取废次烟叶中烟碱的工艺，获得了优化的微波提取工艺条件，该方法尚未见报道。

1　仪器与试剂

1.1仪器 UV-2100紫外可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器有限责任公司）；NMS72SF型微波炉（上海微波炉有限公司）；FZ102型微量植物粉碎机（上海申光仪器仪表有限公司）；BT25S电子天平（赛多利斯）。

1.2试剂 废次烟叶（Nicotiana tabacum L.，购自黄山市烟草收购站，批号20130824，经黄山学院化学化工学院制药工程教研室柯仲成鉴定为茄科烟草）；99%烟碱对照品（购于西安云芝生物科技有限责任公司，批号20130312），甲基橙、三氯甲烷、乙醇、柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液均为分析纯（中国国药化学试剂有限公司）。

2　方法与结果

2.1烟碱标准曲线的绘制 吸取烟碱标准液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，分别注入60 mL分液漏斗中，加入柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液2 mL、甲基橙溶液2 mL，混合均匀后加入三氯甲烷5 mL，萃取2 min，静置分层，取三氯甲烷层加入1 cm比色皿中，测其波长420 nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，烟碱浓度为横坐标作图，绘制标准曲线，作出回归方程y=-0.022 42+5.462 35x，相关系数为r=0.997 7［15］。

2.2提取液中烟碱的测定 取10.00 g废次烟叶，用微型植物粉碎机粉碎，以一定的固液比加入乙醇，浸泡一定时间后，以一定功率的微波处理一定时间，冷却后于3 500 r/min转速下离心15 min，取上清液1 mL，加入2 mL柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液和2 mL饱和的甲基橙溶液，摇匀后加入5 mL三氯甲烷，震荡2.5 min，静置分层。取三氯甲烷层加入1 cm比色皿中，测其420 nm处吸光度［13，16］。根据测得的吸光度，用回归方程计算出对应的浓度，计算烟碱提取率。

2.3Box-Behnken设计-效应面法优化微波提取工艺条件

2.3.1试验设计与结果 根据预试验结果，烟碱微波辅助提取较为显著的影响因素有浸泡时间、微波辐射时间、固液比、微波功率和提取次数等。考虑到提取次数为非连续变量因素，回归方程处理较为复杂，故根据实际情况，将其固定为1次。根据星点设计的研究思路和Box-Behnken的中心组合试验设计原理，对各因素进行3水平试验设计，用代码值-1、0、1来表示。代码值所代表的实际值见表1，试验设计与结果见表2。

表1　Box-Behnken试验因素与水平

表2　Box-Behnken试验设计与结果

多元线性回归：Y=87.67+2.50X1+4.24X2+1.99X3+ 5.56X4（r2=0.831 7）

由表3回归方程的方差分析结果可知，在本实验设定的区域范围内，浸泡时间、微波辐射时间、固液比、微波功率对烟碱的提取率有极显著的影响，浸泡时间和固液比、固液比和微波功率的相互作用具有非常显著影响，浸泡时间和微波辐射时间的相互作用具有显著影响。浸泡时间和微波功率、微波辐射时间和固液比、微波辐射时间和微波功率的相互作用没有显著影响。回归方程失拟检验不显著，说明其他未知因素对该试验干扰比较小。拟合检验极显著，说明该二项式方程与实际提取情况拟合很好，较好地反映了烟碱提取率和浸泡时间、微波辐射时间、固液比、微波功率的关系。因此，该二项式方程较好地描述了烟碱提取率随各个因素的变化规律，具有良好的预测指导性［17-21］。

表3　回归方程的方差分析

2.3.3效应面优化和预测 根据二次多项式数学模型，应用Design-Expert8.0.6软件，绘制考察指标与影响较显著的两个自变量的三维效应曲面图及等高线图，如图1所示。利用回归模型进行分析，预测烟碱的提取率最大值为98.43%，最优提取工艺条件为：浸泡时间为6 h，微波辐射时间7 min，固液比为0.1，微波功率为800W。

2.3.4验证试验 根据预测得出的最优提取工艺条件，平行进行3次验证试验，烟碱的提取率分别为97.23%、96.58%、97.35%，平均值为97.05%，RSD为1.5%，偏差率=（97.05%-98.43%）/98.43%=-1.40%，表明所建立的数学模型具有准确的预测性，所选工艺条件具有较好重复性。

3　讨论

在多数的情况下，各因素对效应的影响并非是线性的，国内一般采用正交试验设计和均匀试验设计优化工艺、筛选处方，即用线性数学模型进行拟合，虽然试验次数较少，但是精确度较低，预测性较差。选择适合于非线性拟合的实验设计方法，可以提高优化效果，Box-Behnken设计-效应面法就是一种较为成熟的方法。本实验采用这种方法，可以评价指标和因素间的非线性关系，充分考虑了各因素之间的交互作用，提高了实验准确性和预测性，已被较多地应用于化学合成过程、生物过程等优化，具有较好的应用价值前景。

图1　各因素对响应值影响的三维效应曲面图和二维等高线图

效应面优化法在药物制剂中应用较为广泛［22-25］，但还没有很好地应用于现代中草药行业中。本研究采用Box-Behnken设计-效应面法对微波辅助提取烟碱的工艺进行了优化，并进行验证试验，为其进一步开发应用提供了科学合理的理论和实验依据。

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R284.2

B

1001-1528（2015）03-0670-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.049

2014-05-09

国家自然科学基金项目（21271006）；安徽省大学生创新创业训练项目（AH201310375027）；安徽省优秀青年人才基金重点项目（2013SQRL088ZD）；黄山学院自然科学研究项目（2012xkj006）

黄 飞（1983—），男，硕士，助教，主要从事药物新剂型与新技术研究。Tel：（0559）2546625， E-mail：huangfei@hsu. edu.cn