高效液相色谱法同时测定款冬花中四种酚酸

冯海燕， 杨晓辉， 岳红坤， 陆 敏， 李彦楠

(石家庄学院化工学院，河北石家庄 050035)

款冬花(Farfaraeflos)为菊科多年生草本植物款冬的干燥花蕾，具有润肺下气、化痰止咳之功效[1]。近年研究表明，款冬花除含有倍半萜、黄酮、生物碱和挥发油外，还含有酚酸类成分[2]。酚酸是一类具有多种药理活性的天然产物[3，4]，是款冬花药效发挥的一种重要物质基础。

款冬花中绿原酸[5，6]或没食子酸[7]的分析方法已有研究，但同时对这两种酚酸进行测定目前尚未见报道。本研究建立了同时测定款冬花中绿原酸、没食子酸、咖啡酸及阿魏酸4种酚酸的高效液相色谱方法，并对不同来源的款冬花药材进行含量比较。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本，岛津公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

没食子酸(GA，批号：110831-200803)、咖啡酸(CA，批号：110885-200102)、绿原酸(CHA，批号：110753-200413)及阿魏酸(FA，批号：110773-201012)，均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，乙酸及其他有机溶剂均为分析纯，水为艾科浦制水机制超纯水。

款冬花药材购自石家庄不同药店。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的制备精密称取绿原酸6.0 mg，咖啡酸6.5 mg，没食子酸6.5 mg、阿魏酸7.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，得单个酚酸储备溶液，于4 ℃冰箱中避光保存。准确吸取4种储备液各1 mL于50 mL容量瓶中，用流动相定容得混合标准溶液，使用时将此溶液稀释成一系列浓度的标准溶液。

1.2.2款冬花样品溶液的制备准确称取款冬花粉末约3.0 g，加入25倍量甲醇，室温浸泡24 h，在功率200 W的条件下超声提取2次，每次40 min。合并滤液，减压浓缩，以流动相定容至50 mL，0.45 μm 滤膜过滤后进行检测。

1.2.3色谱条件色谱柱：Sepax Gp-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)。流动相：A-0.5%乙酸水溶液，B -甲醇，梯度洗脱：0～20 min，25%～50%B；20～22 min，50%～25%B；22～27 min，25%B。柱温：30 ℃。检测波长：280 nm。流速：1.0 mL/min。进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 测定条件的优化

实验考察了流动相组成及pH、稀释溶剂、洗脱方式、柱温、流速及进样量对4种酚酸分离效果的影响。结果表明，洗脱方式和稀释溶剂对实验影响较大。采用不同比例的甲醇-乙酸水溶液作流动相等度洗脱时，要么总的分析时间较长，要么时间适中但4种酚酸间分离度变差，尤其是没食子酸和绿原酸间很难较好分离，故实验采用梯度洗脱方式。分别以甲醇和起始流动相作溶剂稀释混合标准溶液进行试验，所得谱图见图1。可以看出，稀释溶剂的不同对绿原酸和没食子酸的谱峰形状有明显影响，以甲醇作溶剂，谱峰前沿出现肩峰，同时谱峰展宽，而以起始流动相作溶剂，峰形变得对称、尖锐。这可能与起始流动相和甲醇极性相差较大有关，实验采用起始流动相做溶剂进行后续实验。在本文所确定的色谱条件下，4种酚酸得到最佳的分离效果(图1b)。

图1 甲醇(a)与流动相(b)做溶剂的混合对照品色谱图Fig.1 Chromatograms of reference substances diluted with methanol(a) and mobile phase(b)

2.2 标准曲线和检出限

精密吸取1.2.1项下不同浓度的混合标准溶液，按上述色谱条件分别进样分析。以峰面积(Y)为纵坐标，以标准品质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，以信噪比(S/N)=3确定各组分的检测限，结果见表1。

表1 4种酚酸的回归方程、相关系数、线性范围和检出限

2.3 精密度试验

准确吸取款冬花样品溶液10.0 μL，按选定色谱条件，平行测定5次，测得没食子酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.76%、1.03%、1.21%和0.92%。

2.4 重复性试验

称取河北产地的款冬花药材粉末6份，每份约3.0 g，按1.2.2项制备样品溶液，分别进样测定。4种酚酸测定结果的RSD均小于1.60%，表明重复性良好。

2.5 加标回收试验

准确称取已知含量的河北产款冬花粉末约1.5 g，添加含量相当的酚酸标准品溶液，按1.2.2项提取，1.2.3项测定，重复进样5次，计算各组分的加标回收率，结果见表2。各组分的平均回收率为92.3%～102.0%，RSD为0.27%～2.70%，说明方法的准确度较高。

表2 回收率测定结果(n= 5)

2.6 样品分析

利用所建立的实验方法，对不同产地的款冬花药材中4种酚酸的含量进行分析，结果列于表3，代表性色谱图见图2。由于绿原酸含量较高，其含量测定需将提取液稀释1倍。

表3 款冬花中4种酚酸含量测定结果(mg/g，n=3)

a:Farfaraefloswas stir-fried with honey.

图2 四川产款冬花样品(a)和加标样品(b)色谱图Fig.2 Chromatograms of samples from Sichuan(a) and the spiked sample(b)

3 结论

建立了同时测定款冬花药材中没食子酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸四种中药活性成分的高效液相色谱方法,为该药材的多指标质量控制提供科学依据。实验结果表明，不同来源款冬花中4种酚酸的含量及其总量不等,以绿原酸含量最高，没食子酸次之。若以总酚酸含量来计，山西(1)产的药材含量最高，达到 5.9618 mg/g。