液相色谱-串联质谱法同时测定黄鳝肌肉组织中6种激素残留

孟 霞， 谢世红， 谢世涛， 徐节华， 刘文珍， 花 麒

(江西省水产品质量安全检测中心，江西南昌 330000)

激素类药物主要包括雌激素、雄激素、孕激素及糖皮质激素等，因其具有影响动物性别分化，提高动物源性产品的产量、缩短动物生长周期的作用，会被非法用于水产养殖中以提高水产品的养殖效率[1 - 4]。激素类药物一般较稳定，不易降解，通过食物链进入人体后，仍具有较强的生物活性及潜在的致癌性[5]。因此，欧盟、国际食品法典委员会(CAC)、美国、日本等均对动物源性食品中激素的残留有严格要求[6]。我国农业部176号、193号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌激素，炔诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，及苯丙酸诺龙等雄激素和蛋白同化激素；235号公告规定己烯雌酚、乙酸甲羟孕酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、甲基睾酮等激素在动物源性食品中不得检出[7]。为了保证黄鳝的食用安全，开展黄鳝中激素的多组分同时监控具有重要的现实意义。

目前，激素类物质的测定方法主要有液相色谱法(LC)[8，9]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[10]、酶联免疫法[11]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[12]等。对黄鳝中性激素多残留测定方法的研究则只见于GC-MS[10]，未见有LC-MS/MS检测方法的研究报道。为有效去除黄鳝肌肉组织的复杂基质和提高提取率，本研究将样品经酶解乙酸乙酯提取后，采取冷冻离心的净化方式去除蛋白和脂肪，建立了LC-MS/MS同时测定黄鳝肌肉组织中苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇、丙酸睾硐、乙酸炔诺硐、左炔诺硐、甲睾硐6种激素类药物残留的方法，为黄鳝中多种激素残留的定性定量分析提供技术支撑和方法借鉴。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1260-6420 UPLC-QQQ型液相色谱-质谱仪(美国，Agilent公司)；G-560E型涡旋混合器(美国，Scientific Industries 公司)；KQ-500B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；T25高速匀浆机(广州仪科仪器有限公司)；KDC-140HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳仪器有限公司)。

6种标准品：苯丙酸诺龙(Nandrolone Phenylpropionate)、苯甲酸雌二醇(Estradiol Benzoate)、丙酸睾酮(Testosterone Propionate)、乙酸炔诺酮(Norethindrone Acetate)、左炔诺酮(Levonorgestrel)、甲睾酮(Methyltestosterone)，纯度均大于98.0%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。准确称取适量的以上6种激素标准品，用甲醇分别配制成1 mg/mL 的单标准储备溶液，以及10 μg/mL 的混合标准工作溶液，于-20 ℃冰箱中保存。将上述单个标准储备溶液分别用甲醇逐级稀释成1 μg/mL的单个标准工作溶液用于优化质谱参数。β葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶复合酶，甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸铵、乙酸均为色谱纯，无水乙酸钠为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 试样的制备及前处理

取黄鳝肌肉约300 g用组织捣碎机捣碎，均质备用。称取5 g 均质试样(精确至0.01 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 0.2 mol/L NaAc缓冲溶液(pH=5.2)，以14 000 r/min均质30 s，再加入30 μLβ葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶复合酶，混匀30 s，置于37 ℃恒温水浴振荡器中酶解16 h。取出冷却至室温，加入15 mL乙酸乙酯，混匀1 min，常温下以4 000 r/min离心10 min，将上层有机相转移至另一50 mL离心管中，下层残渣再以15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上层有机相至上述50 mL离心管中，于40 ℃氮吹至近干。加入2 mL乙腈-水溶液(体积比1∶1)超声溶解残渣，于-20 ℃冰箱冷冻1 h，取出于12 000 r/min下冷冻离心10 min，取适量上清液过0.22 μm针头滤膜至样品瓶中，供LC-MS/MS测定。

1.3 基质匹配混合标准溶液的配制

空白试样按1.2节方法处理。取适量空白样品提取液，加入一定量的混合标准工作溶液混匀，配制成系列浓度的基质匹配混合标准溶液。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1色谱条件Agilent SB -C18色谱柱(50×2.1 mm， 1.8 μm)；柱温：35 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A相为乙腈，B相为水溶液(10%甲醇+0.3%乙酸+0.2%甲酸铵)；梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，70%B;0.5～3.0 min，70%B～10%B;3.0～12.0 min，10%B;12.0～12.1 min，10%B～70%B;12.1～18.0 min，70%B。

1.4.2质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测(MRM)；雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：11 L/min；雾化气压力：15.0 psi；毛细管电压：4 000 V。6种激素类化合物的定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 6种激素类化合物的质谱参数

*quantitative icon.

1.5 定性和定量分析

在正离子模式的测定条件下，分别将样品溶液和基质匹配混合标准溶液进行LC-MS/MS测定，以其基质匹配混合标准溶液峰的保留时间和2对质谱监测离子对为依据进行定性，采用基质匹配外标法以定量离子对的峰面积进行定量。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

在ESI+离子模式下，6种激素类化合物因含有羰基等多电子基团都可形成稳定的[M+H]+准分子离子峰，做相应化合物的选择离子监测(SIM)，优化其碎裂电压(Fragmentor)及毛细管电压，使[M+H]+母离子的传输效率最大，然后对母离子做子离子全扫描(Product Icon Scan)，获得碎片离子信息，同时结合基质空白和基质标准溶液的离子扫描图，选择受基质影响较小且丰度较高的2个特征碎片离子分别作为定性与定量离子，优化碰撞能量使其响应最大，最后得到各化合物的定性定量离子对及相应的质谱参数，结果见表1。

2.2 色谱条件的优化

6种激素类化合物都属于弱极性化合物，在反相C18固定相中有较好的保留。本实验选择Agilent SB-C18色谱柱作为分离柱，正离子模式下在流动相B相的水溶液中加入0.3%乙酸有利于化合物的离子化，改善峰形，并提高质谱检测的灵敏度。在流动相B相的水溶液中加入10%甲醇和0.2%甲酸铵溶液可以促进离子化效率。基于液相色谱分离的特点和要求，在优化的流动相条件下，通过1.4.1项的梯度洗脱实现6种激素类药物的快速分离，且峰形良好。实验发现采用不同的溶剂作为样品处理后的复溶溶液会对质谱响应及色谱峰形产生显著影响。6种激素属于脂溶性化合物，弱极性，不溶于水，经多次试验，确定以50%乙腈-水溶液作为样品处理后的复溶溶液，可获得对称、尖锐的峰形和良好的质谱响应。

2.3 样品前处理条件的优化

激素经动物体吸收后会与基质中的蛋白质结合，以葡萄糖醛酸结合态形式存在,因此对试样进行酶解、酸或碱水解十分必要。较之酸水解和碱水解的剧烈性，酶解更温和彻底。本实验采用β葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶复合酶制剂对试样中的结合态激素进行酶解释放，以提高检测的准确性。

实验比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等溶剂的提取效果，发现甲醇、乙腈难于浓缩且提取回收率并不比乙酸乙酯和叔丁基甲醚的提取回收率高，而叔丁基甲醚易与缓冲溶液发生乳化提取效果不佳，因此本实验选择了提取回收率相对较高且易于浓缩的乙酸乙酯作为提取溶剂。

6种激素均属于弱极性的脂溶性化合物，在正己烷中有一定的溶解度，直接用正己烷去脂时会出现部分损失。本实验还选用了反相的C18和HLB固相萃取小柱进行净化试验，但样品提取液会堵塞两种固相萃取柱，都不能有效地去除干扰，且降低了回收率。由于LC-MS/MS本身具有较强的抗干扰能力，故本方法采用低温脱脂的净化方式，可获得背景信号较低的MRM离子流色谱图。

基质效应是指当色谱分离时共洗脱的物质改变了待测组分的离子化效率，所引起信号的提高或抑制。当基质效应影响大时，会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性。由于黄鳝中的蛋白质和脂肪含量较高，其它各种内源性杂质也很多，在进行激素类药物的LC-MS/MS检测时会有明显的基质效应。为最大限度消除基质效应干扰，本实验采用基质匹配标准溶液法进行外标定量分析。以空白试样的提取液作为标准溶液的稀释溶液，为标准溶液提供与样品溶液相似的离子化环境，从而消除基质效应。

2.4 线性范围与检出限

在0.5～100 μg/kg质量浓度范围内，苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮、乙酸炔诺酮、左炔诺酮及甲睾酮等6种激素类药物的线性良好，相关系数r均大于0.99。采用空白样品添加低浓度的标准品，按方法规定进行前处理，然后上机测定，以3倍信噪比作为检出限(LOD),10倍信噪比作为定量限(LOQ)，黄鳝肌肉中苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮、乙酸炔诺酮、左炔诺酮及甲睾酮LOD为0.25～1.0 μg/kg，LOQ为 0.5～2.0 μg/kg，结果见表2。

2.5 准确度与精密度

向空白试样中添加6个浓度水平的6种激素类化合物混合标准溶液，按前述处理方法及测定条件进行回收率实验，每个添加水平做6个平行，结果见表3。各化合物的平均回收率为70.5%～107.2%，相对标准偏差(RSD)为3.9%～9.5%，均符合残留检测有关标准和法规的要求。

2.6 实际样品测定

采用本方法对江西市场及产地54批次样品进行测定，均未检出6种激素类药物残留。

表2 6种激素类药物的线性方程、检出限和定量限(n=6)

表3 6种激素类化合物在黄鳝肌肉组织中的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

3 结论

本文建立了液相色谱-串联质谱法同时测定黄鳝肌肉组织中苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮、乙酸炔诺酮、左炔诺酮、甲睾酮等6种激素类药物残留的方法。在优化的实验条件下，6种激素用Agilent SB-C18色谱柱分离后，在LC-MS/MS多反应监测模式下进行定性及定量分析。该方法试样的前处理简单快速，灵敏度高，准确度和精密度好，适用于黄鳝等蛋白脂肪含量高的动物组织中激素类药物多残留的同时测定。