超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水和沉积物中磺胺类、喹诺酮类和氯霉素类抗生素残留

尹燕敏， 沈颖青， 朱月芳， 秦宏兵

(1.苏州市环境监测中心,江苏苏州 215004;2.江苏省环境监测中心，江苏南京 210036)

抗生素是人们接触最为频繁、用量最大的一类药物，其环境行为和效应已受到关注[1]。该类药物通过多种途径进入环境后，可抑制环境中有益微生物的活性，刺激病原菌产生抗药性，从而对陆生或水生生态系统产生负面效应[2]。环境中的抗生素长期存在可直接影响到饮用水的安全，并通过食物链潜在影响人体健康。进入水环境中的抗生素不仅种类繁多，且多以ng/L级的低浓度存在[3，4]，而沉积物则基体复杂。因此，急需水环境及沉积物中抗生素残留灵敏、准确、快速的分析方法，为抗生素环境行为(分布、迁移转化、降解动态、生物富集)和生态效应的研究提供必要的技术手段。

迄今为止，国内对环境中抗生素的报道多为分析方法研究[5 - 10]，对于污染水平研究还很欠缺，也没有一个国家标准方法可以参照。本研究结合实际情况，将固相萃取(SPE)及加速溶剂萃取技术(ASE)与超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)相结合，建立水和底泥中20种常见抗生素的分析方法，通过优化样品分离、富集和净化等前处理条件，以及液相色谱-串联质谱等相关参数，建立灵敏度高、选择性好、准确度高的痕量药物检测方法。运用建立的方法调查苏州市地表水及底泥样品中20种目标药物残留状况，并进行结果分析，为后续研究提供技术和数据基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UPLC-XEVO-TQMS超高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪(美国，Waters公司)；Caliper Autotrace SPE(6位)；Dionex ASE-300型加速溶剂萃取仪 (美国)，配34 mL 和66 mL萃取池；EYELA MG-2200氮吹仪。

磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺-2-甲基嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺乙酰、磺胺噻唑、磺胺吡唑、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异恶唑、磺胺喹恶啉、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、环丙沙星、甲砜霉素、氟甲砜霉素及氯霉素标准品，均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(Merck公司)；氢氧化钠、乙酸铵为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 样品处理

1.2.1地表水样品水样前处理采用固相萃取。固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL甲酸溶液(pH=3)进行活化。水样经0.45 μm 滤膜过滤后取500 mL水样，加入0.5 g EDTA，调pH后过小柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用12 mL洗脱液进行洗脱，收集洗脱液氮气吹至近干后用初始流动相定容至1 mL，过0.2 μm膜后，进样分析。

1.2.2沉积物样品沉积物样品处理采用加速溶剂萃取。取5 g新鲜底泥样品冷冻干燥后加入无水硫酸钠，再加入1 g弗罗里硅土，混匀后装入66 mL的萃取池中。所用溶剂为乙腈与乙酸乙酯(1∶1，V/V)，温度80 ℃，压力1 500 psi，预热5 min，静态提取5 min，重复2次，用40 mL溶剂快速冲洗样品，氮气吹扫收集全部提取液后，将其吹至近干，初始流动相定容至1 mL，过0.2 μm膜后，进样分析。

1.3 仪器条件

色谱条件：UPLC BEH C18色谱柱(50×2.1 mm,1.7 μm);流动相:10 mmol/L乙酸铵(0.01%甲酸)(A相)和乙腈(B相)，流速为0.4 mL/min。梯度条件：0 min，95%A；7.0 min，80%A；7.5 min，80%A；8 min，0%A；8.5 min，95%A。柱温35 ℃；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；源温度和脱溶剂气温度分别为150 ℃和500 ℃ ；脱溶剂流速和锥孔气流速分别为1 000和50 L/h；毛细管电压为3.5 kV。检测方式为MRM模式。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

采用多反应监测模式(MRM)对目标化合物进行分析。磺胺类及喹诺酮类抗生素在正离子模式下，全扫描的分子离子[M+H]+最理想，而氯霉素类在负离子模式下的分子离子[M-H]-理想，因此对于两类目标化合物分别选用[M+H]+及[M-H]-作碰撞诱导解离的母离子。在MS/MS模式下，优化锥孔电压、碰撞电压、毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度等条件进行了优化，结果见表1。

表1 目标化合物的质谱条件

2.2 色谱条件优化

用液相色谱-质谱法分析磺胺类及喹诺酮抗生素常用的流动相为甲酸水溶液与乙腈或甲醇按比例混合。但是氯霉素类抗生素采用ESI-模式测定，酸的加入影响ESI-的灵敏度。传统液相色谱-质谱联用采用ESI-分析时，流动相中适当加入铵盐可改善目标分析物的电离情况，增强ESI-的灵敏度。当水相中同时添加乙酸铵和甲酸时，有利于目标分析物的分子离子化，目标化合物的色谱峰峰形得到极大改善。

本实验考察了以乙腈-10 mmol/L乙酸铵(分别含0、0.01%、0.02%、0.05%和0.1%甲酸)作为流动相对目标化合物的影响。结果表明在甲酸含量为0时，喹诺酮类无法洗脱，随着甲酸浓度增加，目标化合物的响应有所下降，同时峰形展宽。根据峰形、响应强度及分离度等因素，综合考虑选择乙腈-10 mmol/L乙酸铵(0.01%甲酸)为流动相。

2.3 地表水样品前处理优化

影响固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱类型、样品pH、上样速度等，采用空白加标对上述因素进行优化。实验分别考察了HLB柱和普通C18柱对目标化合物的萃取效果，研究发现HLB柱对目标化合物的萃取效率高于C18柱。因此，本文采用HLB柱对样品进行富集和净化。比较了样品pH为3和7的空白加标水样的提取效率。发现pH为3时的提取效率优于pH为7的效率，因此水样用1 mol/L H2SO4调至pH等于3。实际水样中通常含有一定量的金属离子，易与抗生素螯合，给提取带来困难，利用EDTA能有效降低抗生素与金属离子的螯合。以Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+做干扰试验，发现有上述离子存在时，目标化合物的回收率为11.4%～59.6%；加入EDTA后，回收率为68.4%～92.1%，且结果相对稳定，所以本实验中加入EDTA以络合部分金属离子。分别用甲醇、乙腈和酸化的甲醇(0.01%甲酸)作为洗脱液进行洗脱，发现使用甲醇和乙腈洗脱效率低于酸化的甲醇，因此，洗脱液采用含0.01%甲酸的甲醇溶液。上样流速分别为5、10 mL/min时，空白加标的回收率没有显著差异，选择上样速率为10 mL/min。

2.4 沉积物样品前处理优化

首先，准确称取5.0 g底泥样品，置于50 mL离心管中。加入10 mL乙腈/水(25∶75,V/V)溶液(用稀氨水调节至pH=10)，涡旋1 min，超声提取15 min后，4 ℃离心10 min(4 500 r/min)。取出上清液，残渣再加入10 mL提取溶液，重复上述步骤。但是由于离心效果不好，无法实现分离。因此，采用加速溶剂萃取处理沉积物样品。选用甲醇/乙酸乙酯(1∶1,V/V)，甲醇/丙酮(1∶1,V/V)，乙腈作为提取剂考察提取效率。发现以甲醇/乙酸乙酯作为提取剂时，喹诺酮类和氯霉素类的提取效率满意，而磺胺类的提取效率介于12.5%～60.3%；采用甲醇/丙酮作为提取剂时，氯霉素类的提取效率满意，而磺胺类的16.4%～66.4%，喹诺酮类的提取效率介于16.4%～37.1%；采用乙腈作为提取剂时，大部分磺胺类的提取效率满意，氯霉素类的提取效率满意，而喹诺酮类的提取效率介于18.7%～30.9%。采用乙腈与乙酸乙酯混合作为提取溶剂，优化乙腈与乙酸乙酯的比例，选择乙腈与乙酸乙酯比例分别为5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1时，发现随着乙酸乙酯的比例增加喹诺酮类的回收率逐渐增加，而磺胺类的回收率逐渐下降，而氯霉素类的回收率则影响不大。综合考虑，最终选择乙腈与乙酸乙酯的比例为8∶2。

在其它萃取条件不变的情况下，选择60、70、80、100 ℃ 4个提取温度进行研究，结果表明提取温度对样品加标回收率的影响很大。当提取温度超过60 ℃，大部分化合物的加标回收率明显提高，但当温度超过80 ℃时提取杂质增多，结果重复性差。与60、70、100 ℃时相比，80 ℃的提取效果较好，除磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺氯哒嗪外，样品的加标回收率均在40%～130%之间。这可能是由于随着温度的升高，溶剂的粘度下降，从而加强了溶剂浸润基质和溶解目标分析物的能力。加入的热能同时也有助于破坏目标化合物与基质之间的作用力，增强目标分析物从基质表面扩散到溶剂中的能力，从而提高萃取回收率。但随着温度进一步提高，可能促进了部分抗生素的分解，导致回收率降低，所以实验选择最佳提取温度为80 ℃。

2.5 方法线性范围和检出限

将抗生素储备液(1 000 mg/L)用初始流动相稀释为0.5～50 μg/L的标准系列溶液，按照1.3节的仪器条件进行分析。以定量离子对的响应面积(Y)和对应浓度(X)进行线性回归得到标准曲线。结果表明在此范围内具有良好的线性关系。以3倍信噪比(S/N≥3)估算方法检出限，水样和沉积物中20种目标化合物的方法检出限分别为0.01～0.50 ng/L和0.005～0.2 μg/kg之间，其线性方程、相关系数、检出限等见表2。

表2 目标化合物的回归方程、相关系数及方法检出限

2.6 方法精密度及加标回收率

取空白水样，分别制得浓度为4.0、40.0和100 ng/L加标水平的加标样品，按照1.2节方法进行样品前处理，外标法定量计算，每个浓度水平重复测定6次，得到添加浓度水平为4.0～100 ng/L时，各目标化合物的平均回收率在68.0%～132%之间，相对标准偏差为4.27%～16.0%；取空白土壤样品，分别制得浓度为1.0，10.0和50.0 μg/kg加标水平的加标样品，按照1.2节方法进行样品前处理，外标法定量计算，每个浓度水平重复测定6次，得到添加浓度水平为1.0～50.0 μg/kg时，各目标化合物的平均回收率在45.3%～110%之间，相对标准偏差为5.94%～20.5%，结果显示了较好的回收率与精密度，可满足地表水和沉积物中抗生素检测的要求。

2.7 实际样品分析

应用本方法对苏州地区东太湖流域、阳澄湖及京杭大运河苏州段等不同来源20余个点位的地表水及底泥样品进行分析测定。结果表明，对于地表水样品，共有磺胺乙酰、磺胺甲基异恶唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星10种抗生素检出，浓度范围为0.79～240 ng/L，其中检出浓度最高的是磺胺类抗生素磺胺邻二甲氧嘧啶，检出率最高的是氟甲砜霉素，检出率为100%；对于沉积物样品，共有磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星11种抗生素检出，浓度范围为0.37～27.0 μg/kg，其中检出浓度最高的是磺胺类抗生素磺胺邻二甲氧嘧啶，检出率最高的是氟甲砜霉素，检出率为100%。在所有样品中，各个监测点都有不同浓度和组成的药物残留，表明了这些药物在生产、消费、处方和使用等模式上的区域差异，与其他药物相比，检出比例达80%以上的抗生素是磺胺类药物磺胺甲基异恶唑及氯霉素类药物甲砜霉素和氟甲砜霉素。证明了此类药物的广泛使用。

3 结论

建立了水样和沉积物样品中喹诺酮和磺胺类抗生素的超高效液相色谱三重四级杆质谱联用分析方法。该方法在9 min 内完成对20种目标化合物的分析，对于水样和沉积物样品的方法检出限分别在0.01～0.50 ng/L和0.005～0.2 μg/kg之间，外标法定量准确性较好，地表水和相应的沉积物测定结果表明地表水和沉积物中已经受到抗生素污染。