液相色谱-质谱/质谱法检测人参和土壤中多菌灵的残留动态

崔丽丽, 闫梅霞, 王春伟， 许允成， 王 燕， 高 洁*

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112； 2.吉林农业大学农学院,吉林长春 130118)

目前国内外己有记载的人参病害有40余种，我国己发现的人参病害至少在25种以上[1，2]，国内常见侵染性病害主要有黑斑病、灰霉病、立枯病、菌核病、疫病、锈腐病、猝倒病、根腐病、炭疽病等[3]。文献报道在韩国影响人参产量的真菌病害有炭疽病(Colletotrichumgloeosporoides)、立枯病(Pythiumdebaryanum,Pythiumultimum,andRhizoctoniasolani)、疫病(Phytophthoracactorum)、灰霉病(Botrytiscinerea)、黑斑病(Alternariapanax)6种[4，5]。多菌灵(Carbendazim)属苯并咪唑类高效低毒内吸性广谱杀菌剂[6]，可用于防治大田作物、蔬菜、果树及经济作物的多种病害[7]。多菌灵主要用来防治人参立枯病和人参锈腐病[3,8]。我国已制定多菌灵在谷物(如大米、小麦和玉米)，油料(如大豆、花生仁和油菜籽)，蔬菜(如黄瓜、番茄、芦笋、辣椒和韭菜)，水果(如葡萄、苹果、梨、西瓜、油桃和香蕉)，甜菜和茶叶中的最大残留限量(MRL)值为0.05～5.00 mg/kg[9]。日本、欧盟和韩国分别制订了多菌灵在人参中的最大残留限量标准，日本为3.0 mg/kg，欧盟为0.1 mg/kg，韩国为0.5 mg/kg(干人参和红参)和0.2 mg/kg(鲜参)[10]，但我国尚未规定人参中多菌灵残留限量值。

多菌灵在人参生长期的残留动态已有文献报道[8]，采用高效液相色谱法(HPLC)和高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定人参及人参制剂、西洋参中多菌灵残留量[11 - 16]。拌土施药是多菌灵常用施药方式，同时LC-MS/MS在食品、环境等领域的农残分析应用越来越广泛，为此设计了两年两地残留试验研究50%多菌灵可湿性粉剂在人参中的残留动态及最终残留水平，建立了LC-MS/MS法检测多菌灵残留量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

API 4000液相色谱-质谱/质谱联用仪(美国，Applied Biosystems公司)，配有电喷雾离子源；组织捣碎机(20 000 r/min)；旋转蒸发仪SA31(瑞士，Büchi公司)；Mettler PL1500-s电子天平(0.01 g)；彩色单道移液枪(1、5、10 mL)(德国，Eppendorf有限公司)；GPR固相萃取柱(迪马公司ProElut GPR，粒径1.5 g/12mL)；离心机(10 000 r/min)。

多菌灵标准品(纯度98.0%，购自国家标准物质研究中心)；50%多菌灵(利民化工股份有限公司)；甲苯为色谱纯；乙腈、甲酸均为分析纯；水为GB/T6682规定的一级水。

供试作物：人参(二年人参)，产地吉林省抚松兴参镇和集安市榆林镇，品种为大马牙。

1.2 消解动态试验

1.2.1人参试验共设50%多菌灵和空白对照2个处理，3次重复，小区面积为15 m2。采用拌土施药法施药，施药剂量为52 500 g a.i./hm2(高剂量)。施药后0 d(在施药拌土后2 h之内)、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 5点法取样，参根约1.0 kg。同期采集未施药处理的人参样品，标签标记后，于-20 ℃条件下保存，待测。

1.2.2土壤选一块15 m2的地块，单独进行拌土施药，剂量52 500 g a.i./hm2，拌土后0 d(2 h)、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 和收获期分别采样，另设清水空白对照。土壤样本的采集：随机取点5～10个，用土钻采集0～10 cm的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、杂草和植物根茎等杂物，混匀后用四分法取样500 g，装入样本容器中，贴好标签，贮存于-20 ℃冰柜中保存。

1.3 最终残留试验

试验设2个施药剂量35 000 g a.i./hm2和52 500 g a.i./hm2，拌土施药1 次，每处设3次重复和1个未施药的空白小区。采样时间距离施药间隔时间为在浇灌后28 d、35 d和收获期的根和土壤样品。采样方法同消解动态。

1.4 样品处理

1.4.1提取称取-20 ℃冷冻保存的鲜人参、土壤各100 g，依次用捣碎机将样品粉碎，取1 g样品于50 mL离心管中，加入0.1%甲酸水溶液20 mL，用涡漩混匀器混合1 min后，以8 000 r/min离心5 min，取上清液，再向离心管中加入20 mL 0.1%甲酸水溶液，重复提取一次，合并上清液，于35 ℃下旋转蒸发至近干，加入乙腈-0.1%甲酸(3∶1,V/V)5 mL溶解，待净化。

1.4.2净化用10 mL乙腈-0.1%甲酸(3∶1,V/V)预淋洗GPR固相萃取柱，流出液弃去。将5 mL溶解液倾入GPR固相萃取柱中，用20 mL乙腈-0.1%甲酸(3∶1,V/V)进行洗脱。收集全部洗脱液于鸡心瓶中，于温度35 ℃水浴中旋转浓缩至近干。用0.1%甲酸溶解残渣并定容至5 mL，经 0.22 μm 滤膜过滤后,供 LC-MS/MS法测定。

1.5 液相色谱与质谱条件

色谱条件：Kromasil Eternity-5-C18色谱柱(150×2.1 mm)；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，流速250 μL/min。梯度洗脱程序：0～8 min,50%B;8～12.1 min,90%B;12.1 min,50%B,保持至25.0 min。柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：离子源温度：725 ℃； 扫描方式：正离子扫描；多反应监测；电喷雾电压：5 500 V；雾化气压力：0.483 MPa；气帘气压力：0.138 MPa；辅助加热气压力：0.379 MPa；监测离子对为m/z192.1/132.0，m/z192.1/160.1(定量离子)、碰撞气能量分别为25、41 eV，去簇电压27 V。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与最低检测浓度

用0.1%甲酸水溶液溶解多菌灵标准品，配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5 μg/mL系列标准溶液。以多菌类的质量浓度(x)为横坐标，以色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，多菌灵在0.01～0.5 μg/mL浓度范围内，其浓度与响应值有良好的线性关系(r2=0.9985)，线性方程为：y=9.54×106x+3.11×105，在优化测定条件下多菌灵在人参和土壤中的最低检出浓度为0.005 mg/kg。

2.2 添加回收率

取空白对照区人参和土样进行添加回收率试验，共设0.01 mg/kg、0.02 mg/kg和0.2 mg/kg 3个添加浓度，5次重复。从表1可看出，相对标准偏差(RSD)为2.85%～6.28%，表明使用上述检测方法分析人参和土壤中多菌灵，结果精密度好、准确可靠。

表1 多菌灵回收率(n=5)

2.3 残留动态试验

2011年与2012年多菌灵的残留动态试验结果见表2、表3。分析样品分别来自吉林省抚松县(Sample 1)和集安市(Sample 2)。

抚松和集安两年两地的残留数据结果表明多菌灵在人参中的半衰期为11.6～13.7 d，在土壤中的半衰期为10.4～13.0 d，说明多菌灵在人参和土壤中属于易降解农药(t1/2<30 d)(表2和表3)。

表2 多菌灵在人参中的残留动态

表3 多菌灵在土壤中的残留动态

2.4 最终残留试验

在人参苗进行移栽时采用拌土施药法施用50%多菌灵可湿性粉剂， 在35 000 g a.i./hm2、52 500 g a.i./hm2剂量下，施药后65 d人参上的多菌灵最终残留量均低于0.0332 mg/kg，土壤中的多菌灵最终残留量均低于0.0428 mg/kg，结果见表4。

表4 多菌灵在人参和土壤中的最终残留结果

3 结论

两年两地残留试验结果表明，50%多菌灵可湿性粉剂用药量35 000～52 500 g a.i./hm2，施药1次，采收间隔期为28 d、35 d、65 d，在人参中的半衰期为11.6～13.7 d，在土壤中的半衰期为10.4～13.0 d，残留量分别是0.0075～0.0332 mg/kg(人参)和0.0068～0.0428 mg/kg(土壤)。因此，建议50%多菌灵可湿性粉剂在人参中的MRL值为0.5 mg/kg，最高用药量52 500 g a.i./hm2，安全施药间隔期 28 d。