气相色谱-质谱法结合偏最小二乘-判别分析用于血清和血浆中代谢物的比较分析

石书婷， 章晓娟， 易伦朝

(中南大学化学化工学院， 湖南长沙 410083)

代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化研究生物体系的一门学科[1]。大量文献已经报道，血浆[2，3]、血清[4]、尿液[5]、脑脊髓液[6]等生物体液都可作为代谢组学的分析对象。Denery等[7]提出血清中多肽类和蛋白质类成分比血浆中多。然而对于血清和血浆之间小分子代谢物的差异分析则鲜有报道。

气相色谱-质谱(GC-MS)联用法因灵敏度高、重现性好及检测限低等优点而被广泛应用于代谢组学研究[8，9]。夏鑫华等[10]采用硅烷化反应检测了大鼠血液中的23种内源性代谢物。本文对肟化-硅烷化的柱前衍生法进行优化，并用化学对照品对方法的重复性、精密度、回收率等进行考察，得到了准确可行的人体血清和血浆中代谢物的GC-MS分析方法。研究结果表明，血清、血浆中代谢物的种类和含量均有差异，为代谢组学研究中血清和血浆样本的选择提供了依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪(日本，岛津公司)，岛津气质联用工作站和NIST05质谱库。

甲醇(99.95%，江苏汉邦公司)；N,O -双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷(BSTFA+1%TMCS)，甲氧胺盐酸盐，吡啶，十七酸均购于美国Sigma公司，纯度均为99.0%；β-羟基丁酸，焦谷氨酸，亚油酸，胆固醇均购于百灵威科技有限公司，纯度均为99.0%。

1.2 样本前处理

健康人血清、血浆样本从-80 ℃低温冰箱取出后，常温下解冻，取100 μL置于1.5 mL离心管中，加入50 μL内标十七酸甲醇溶液(1 mg/mL)，涡旋15 s，再加入350 μL甲醇去除蛋白，涡旋1 min，静置8 min，离心10 min(16 000 r/min,4 ℃)，取400 μL上清液置于试管中，N2吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶(20 mg/mL)，涡旋15 s，70 ℃下肟化反应1 h后，加入100 μL硅烷化试剂(BSTFA+1%TMCS)，涡旋15 s，70 ℃水浴反应1 h后涡旋混匀，取1 μL进样分析。

1.3 GC-MS分析条件

色谱柱：Agilent DB-5ms熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：280 ℃；初始柱温：70 ℃，保持4 min，以8 ℃/min程序升温至300 ℃，保持3 min；柱流速：1 mL/min；分流比：10∶1；载气：He；接口温度：250 ℃。离子源(EI)温度：200 ℃；质量范围：m/z35～800；扫描间隔：0.2 s；电子倍增器电压：0.9 kV；溶剂切除时间：6.5 min。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1线性关系考察精密称取对照品β-羟基丁酸、焦谷氨酸、亚油酸、胆固醇适量，加甲醇定容，配成含β-羟基丁酸、焦谷氨酸、亚油酸、胆固醇均为5 mg/mL的混合对照品溶液。将配好的混合对照品溶液逐级稀释成5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.75、0.50、0.25、0.01 mg/mL系列混合标准品溶液。N2吹后进行两步衍生，涡旋混匀后进样1 μL测定。以样品和内标的峰面积比值(y)为纵坐标，样品的原始浓度(x,mg/mL)为横坐标，进行线性回归。结果表明，各对照品的响应强度与质量浓度均呈良好的线性关系，回归系数均在0.99以上，能满足检测要求。

2.1.2重复性及精密度考察重复性试验：平行制备同一混合标准品溶液5份进行两步衍生后分别进样，计算得到各物质的相对标准偏差(RSD)在1.80%～9.26%之间。精密度试验：取同一混合标准品衍生后,1 d内(0、3、6、9、12 h)进样5次，得到日内RSD在0.38%～3.61%之间；取同一混合标准品衍生后连续5 d同一时间进样测定，得到日间RSD在2.65%～5.65%之间。结果表明，本文采用的分析方法对以β-羟基丁酸、焦谷氨酸、亚油酸、胆固醇为代表的代谢物来说是稳定、准确和可靠的。

2.1.3回收率考察空白回收率试验：根据标准曲线配制高、中、低浓度的混合标准品溶液，各种浓度均平行制备5份，肟化-硅烷化衍生后分别进样，得到4种对照品的空白回收率分别为86.09%、94.84%、106.3%、92.58%，RSD依次为2.69%、3.49%、7.19%、1.22%；加标回收率试验：根据样本中代谢物的浓度配制混合标准品溶液，加入一定量的样品，按1.2节所示平行制备5份进行处理后进样，得到其加标回收率分别为84.64%、82.22%、92.61%、85.3%，RSD依次为5.81%、4.03%、5.26%、7.02%。结果显示4种代谢物的回收率和相对标准偏差均符合方法学考察的要求。

2.2 血清血浆中代谢物差异的比较分析

2.2.1血清血浆中代谢物种类的差异分析从40个血清样本和34个血浆样本中共检测出80多个代谢物，其中39个为血清和血浆中共有的(表1)。其中，20个为标准品定性，另外19个在NIST05质谱库中检索，相似度均≥85%。分析血清和血浆的总离子流图(图略)发现，保留时间28.035 min处，血浆中存在一个吲哚-3-乙酸峰，这也是血浆中特有的代谢物。除吲哚-3-乙酸峰外，该方法测定的血清和血浆中的代谢物基本相同，主要为脂肪酸、氨基酸、糖类、胆固醇等。

2.2.2血清血浆中代谢物含量的差异分析从表1 可知，在血清和血浆共有的39个代谢物中，有32个代谢物的含量有显著性差异(T=1，p<0.5)，其中25个在血清中含量高于血浆，包括3种有机酸(乳酸、甘油酸和甘露糖酸)，11种氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、正缬氨酸、L-缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及苯丙氨酸)，5种脂肪酸(棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸)，2种糖类(半乳糖和乳糖)，3种醇类(肌酐烯醇、1,5-脱水山梨醇和肌醇)以及尿素；另外7种代谢物在血浆中的含量高于血清，包括4种有机酸(磷酸、2,3,4-三羟基丁酸、柠檬酸和尿酸)，2种糖类(果糖和吡喃葡萄糖苷)以及鸟氨酸。结果表明，代谢物在血清和血浆中的含量有显著差别，对于大部分的氨基酸、脂肪酸和醇类，其血清中的含量均高于血浆；而有机酸和糖类在血清和血浆中的含量高低不一。

图1 血清血浆的PLS-DA投影图(a)和PLS-DA回归系数图(b)Fig.1 Projection plots of PLS-DA for the discrimination between serum and plasma(a) and absolute value of β of each metabolite for discrimination(b)*: β >0.18.

为了筛选出血清和血浆中关键的差异性代谢物，采用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)建立了健康人血清和血浆的判别模型。图1(a)显示了由血清和血浆中共有的39种代谢物建立的PLS-DA判别模型，得到血清和血浆的判别正确率均为100%。图1(b)则是由PLS回归系数筛选出的判别血清和血浆的重要变量(β>0.18，*标示)，5种代谢物分别为磷酸、异亮氨酸、2,3,4-三羟基丁酸、柠檬酸和硬脂酸。以这5个代谢物重新建立血清和血浆的PLS-DA判别模型，模型的正确率为100%。结果表明，这5个代谢物可以反映血清和血浆各自的代谢特征，是区别血清和血浆的关键代谢物。

表1 血清和血浆中内源性代谢物的含量

(续表1)

No.Retention time(min)CompoundConcentration(mg/mL)Serum(n=40)Plasma(n=39)TSerum>plasma3627.558Arachidonic acid*0.022±0.0060.010±0.0041Yes3730.11Glucopyranoside 0.012±0.0020.111±0.2451No3831.248Lactose*0.017±0.0070.007±0.0141Yes3935.171Cholesterol*0.463±0.0500.437±0.1080-

*Identified by standard substances.Data are presented as mean±SD by the ratio of its peaks area to that of the internal standard on the same chromatogram.A p value of <0.05 is considered statistically significant and signed T value is "1",otherwise "0".

3 结论

优化的肟化-硅烷化方法结合GC-MS对血清和血浆中的有机酸、氨基酸、脂肪酸和胆固醇进行了方法学考察，结果表明该方法准确可行，适合于血清和血浆样本的分析。通过对40个健康人血清样本和34个健康人血浆样本中代谢物种类和含量进行分析发现，吲哚-3-乙酸是血浆中的特有代谢物，T检验结果和PLS-DA分析均表明，血清和血浆在代谢物水平上有显著性差异，磷酸、异亮氨酸、2,3,4-三羟基丁酸、柠檬酸和硬脂酸可能成为判别血清和血浆的重要指标。