QuEChERS-高效液相色谱/串联质谱法同时测定蜂蜜中9种新烟碱类杀虫剂残留

粟有志， 李 芳， 齐 鑫， 史秀丽， 王振宝*

(1.伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆伊宁 835000； 2.新疆维吾尔自治区蜂业发展中心，新疆乌鲁木齐 830054)

新烟碱类杀虫剂源于植物源农药烟碱，是继有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂之后的第四大类杀虫剂，为一类昆虫乙酰胆碱受体激动剂[1]。近年来，昆虫学家研究发现新烟碱类杀虫剂与蜂群落崩溃综合症(Colony Collapse Disorder，CCD)有关[2]。有研究表明：当蜜蜂接触新烟碱类杀虫剂时，会迷失回巢方向，蜂王繁殖能力显著下降，从而导致蜂群的数量明显减少[3，4]。因此，建立蜂蜜中新烟碱类杀虫剂残留的分析方法不仅可为保证蜂蜜质量提供技术支持，也可为CCD的研究提供新的分析手段。

当前新烟碱类杀虫剂的分析主要有气相色谱法[5]、液相色谱法[6，7]，气相色谱-质谱法[8]，液相色谱-串联质谱法[9，10]。Fidente等人[11]建立了蜂蜜中啶虫脒，吡虫啉，噻虫啉和噻虫嗪四种新烟碱类杀虫剂残留的液相色谱-质谱(LC-MS)分析方法，但该方法选用单极质谱，基质干扰较大，同时方法检出限也较高。Kamel[12]利用固相萃取前处理，LC-MS/MS同时分析了蜂蜜中7种新烟碱类农药残留，但该法前处理较为费时，成本较高。本文选择高效快捷的QuEChERS技术[13]前处理样品，结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时分析测定蜂蜜中9种新烟碱类杀虫剂残留。该方法操作快速，简单，精密度和回收率均较好，适用于蜂蜜中新烟碱类杀虫剂残留的快速检测和确证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260-6460A型高效液相色谱-串联质谱仪(美国，Agilent公司)；MiIIi-Q AdvangtageA10型超纯水系统(美国，Millipore公司)；Sigma3-18K型台式冷冻离心机(Sigma公司)；MS3型涡旋振荡器(德国，IKA公司)。

啶虫脒、吡虫啉、吡呀酮、噻虫嗪、噻虫啉、烯啶虫胺、噻虫胺标准物质(纯度不低于98%，德国Dr Ehrensterfer公司)；呋虫胺、氯噻啉(100 mg/L，中国农业部环境保护所)。准确称取上述固体标准品10 mg(精确至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1 000 mg/L的单标标准储备液，储存于4 ℃冰箱中备用。将上述9种新烟碱类杀虫剂用纯水稀释并配成10.0 mg/L混合标准液，用蜂蜜空白基质提取液逐级稀释，配制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL基质匹配标准溶液。石墨化碳粉(GCB)、N-丙基乙二胺粉(PSA)、C18粉、酸性Al2O3均购自于Agilent公司。实验用水为超纯水。

1.2 样品前处理

对于无结晶的样品，将其搅拌均匀。结晶样品，在密闭情况下，温度40 ℃水浴，将其全部融化后，搅拌均匀，冷却至室温。称取样品5 g(精确到0.01 g)于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，上下颠倒容量瓶使蜂蜜充分溶解。吸取定容后的提取液1.0 mL置于2 mL塑料离心管，加入PSA和酸性Al2O3各200 mg，涡旋30 s，8 000 r/min离心2 min，取上清液过0.22 μm尼龙膜，滤液待测。

1.3 色谱质谱条件

1.3.1液相色谱条件色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈。梯度洗脱程序：0.0～2.0 min，10%B；2.0～12.0 min，10%～50%B；12.0～12.5 min，50%～90%B；12.5～13.5 min，90%B；13.51～14.50 min，10%B。流速：0.4 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

1.3.2质谱条件电离模式：电喷雾正离子源模式(ESI+)；多重反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流量：9.0 L/min；毛细管电压：4 kV；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11.0 L/min。9种新烟碱类杀虫剂质谱采集参数见表1。

表1 9种新烟碱类杀虫剂的质谱采集参数

*quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

配制10.0 mg/L的9种新烟碱类杀虫剂单一标准溶液，在不接色谱柱的条件下，采用电喷雾正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)分别对9种单标溶液进行母离子扫描，9种杀虫剂的[M+H]+峰均远远高于[M+H]-峰，故实验选择正离子模式。利用安捷伦Optimizer软件对子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行优化。基于优化结果建立的多重反应监测(MRM)质谱分析参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1流动相的选择分别比较了甲醇-0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸铵)、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸铵)、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水6种不同流动相条件下，9种杀虫剂的离子对信号强度。结果表明：流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液时，9种杀虫剂的离子对信号强度均大于其他流动相组合。故本文选择乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相。

2.2.2色谱柱的选择以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，通过设置梯度洗脱程序(1.3.1)，比较9种杀虫剂在Zorbax SB-Aq柱(100×3.0 mm,1.8 μm)、Zorbax Bonus-RP柱(100×3.0 mm,1.8 μm)、Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)三种色谱柱上的分离效果。从图1可以看出：9种杀虫剂在Zorbax Eclipse Plus C18柱上的峰形、响应信号明显优于其他两种色谱柱。

图1 10 ng/mL 9种新烟碱类杀虫剂混标在Zorbax Eclipse Plus C18(a)、Zorbax SB -Aq(b)和Zorbax Bonus-RP(c)色谱柱上的MRM色谱图Fig.1 The MRM Chromatograms of nine neonicotinoid insecticides (10 ng/mL each) in Zorbax Eclipse Plus C18(a),Zorbax SB-Aq (b) and Zorbax Bonus-RP(c) column1.Pymetrozine;2.Dinotefuran;3.Nitenpyram;4.Thiamethoxam;5.Clothianidin;6.Imidacloprid;7.Imidaclothiz;8.Acetamiprid;9.Thiacloprid.

2.3 提取剂和吸附剂的选择

新烟碱类杀虫剂极性较强，本文选择极性较强的溶剂作为提取剂。实验考察了水、丙酮、甲醇、乙腈的提取效果。其中以丙酮、乙腈为提取剂时，蜂蜜与提取剂混不相溶，杀虫剂被蜂蜜中糖分吸附，提取效果较差，9种杀虫剂的回收率均不足10%；甲醇和水均与蜂蜜混溶，均能将杀虫剂完全提取，经净化后两者提取效果相当。考虑分析成本，同时水较为环保和清洁，故本文最终选择水为提取剂。

QuEChERS前处理过程中固相吸附剂对分析农药的吸附会导致回收率降低，影响测定结果的准确性。本文分别考察了吸附剂GCB、PSA、C18粉和酸性Al2O3对9种新烟碱类杀虫剂的吸附效果。以纯水配制的10 ng/mL混标溶液为分析对象，吸附剂GCB、PSA、C18粉、酸性Al2O3用量均为100 mg时，按照公式：吸附率=(纯溶剂中标准品的峰面积-经吸附后纯溶剂中标准品的峰面积)/纯溶剂中标准品的峰面积×100%，计算吸附剂对杀虫剂的吸附效果，结果表明：GCB对9种杀虫剂的吸附率均在50%以上；C18粉对9种杀虫剂吸附率均在40%以上；PSA和酸性Al2O3对9种农药无吸附作用。故本文选择PSA和酸性Al2O3共同净化样品。以颜色较深的杂花蜜为分析对象，9种杀虫剂加标至100 μg/kg，进一步确定吸附剂的用量，比较PSA和酸性Al2O3均为0、50、100、150、200、250、300 mg时样品的净化效果。结果表明：二者的用量均为0～150 mg时，蜂蜜提取液仍然有浅颜色存在，吡呀酮 、呋虫胺 、烯啶虫胺的基质效应较大；二者的用量在200～300 mg时，9种杀虫剂的基质干扰相对减弱，并且基质效应无明显差异。故本文最终确定PSA和酸性Al2O3各200 mg作为吸附剂。

2.4 基质效应的评价

参照文献方法[14]计算基质效应，即：基质效应=(1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100%。结果表明：在杂花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜4种蜂蜜样品中吡呀酮、噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒基质效应均大于20%；其他5种杀虫剂的基质效应均小于20%。一般认为当基质效应(增强或抑制)超过20%，则认为基质效应对定量检测具有显著影响，不可忽略[15]。若选用纯溶剂标准曲线会使定量结果产生偏差，因此本文选择基质匹配标准曲线进行定量，以抵消基质效应的影响。

2.5 方法的线性关系与检出限

配制0.5～20 ng/mL系列空白基质标准工作液，绘制标准曲线，以峰面积对质量浓度做线性回归。杂花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜4种基质中9种新烟碱类杀虫剂在各自的线性范围内具有良好的线性关系(r2>0.9969)；采用空白基质提取液逐级稀释标准溶液的方法，确定检出限和定量限，结果见表2。9种新烟碱类杀虫剂的检出限(LOD，以信噪比大于3计)为0.3～0.8 μg/kg；定量限(LOQ，以信噪比大于10计)为1.0～2.5 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

选择空白样品进行添加9种新烟碱类杀虫剂的回收率试验，在2.5、10、25 μg/kg三个添加水平，每个水平至少重复6次。结果见表2，杂花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜4种基质中9种新烟碱类杀虫剂的平均回收率为81.7%～106.7%，相对标准偏差(RSD)为4.2%～9.4%。该方法的准确性和重复性良好。

表2 9种新烟碱类杀虫剂的检出限、定量限、加标回收率和精密度(n=6)

2.7 实际样品的测定

按照本方法对送检的60余批蜂蜜样品进行检测，结果在油菜蜂蜜样品中检出阳性样品一批，吡虫啉含量为5.2 μg/kg，但未超过欧盟等发达国家的限量要求。吡虫啉是防止油菜蚜虫常用杀虫剂之一，蜂蜜中的吡虫啉可能来自蜂蜜采集的喷洒有农药的花蜜。代表性样品的MRM图如图2。

图2 油菜蜜基质(a)、空白油菜蜜中加标至2.5 μg/kg(b)和含量为5.2 μg/kg吡虫啉油菜蜜样品(c)的9种新烟碱类杀虫剂MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of nine neonicotinoid residues in rape honey matrix(a),blank matrix rape honey spiked with 2.5 μg/kg residues(b) and rape honey containing 5.2 μg/kg imidacloprid(c)1.Pymetrozine;2.Dinotefuran 3.Nitenpyram 4.Thiamethoxam 5.Clothianidin 6.Imidacloprid 7.Imidaclothiz 8.Acetamiprid 9.Thiacloprid.

3 结论

本文以水为提取剂，样品采用QuEChERS方法净化，建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂蜜中吡呀酮、吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫啉、烯啶虫胺、噻虫胺、呋虫胺和氯噻啉9种新烟碱类杀虫剂残留的分析方法。该方法具有简便快捷、提取溶剂环保、准确度好等特点，适用于蜂蜜中新烟碱类杀虫剂残留的快速检测和确证。